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질문 투석 중 침전물 발생은 어떻게 해결해야할까요?
앞다리졸업은언제하나(대학원생)  | 2019.11.29 17:18
첨부파일 파일첨부: 스크린샷 2019-11-29 오후 5.11.33.png (1.64 MB)
이미지 첨부파일

안녕하세요^^

 

현재 대장균에서 단백질 발현 후 IMAC (Ni-NTA레진)정제까지 완료하였습니다.

Eluate에서 imidazole을 제거하기위해 투석을 진행하였는데요..

투석을 진행하면서 농축도 하고 싶어서 DW에 투석 후 (약 45 ml 정도 됨) 동결건조를 시켰습니다.

그런데 투석 후에 용액 내에서 흰색 침전물이 둥둥 떠다니는 것을 확인해서,

투석을 끝내고 동결건조 후 2 ml PBS에 녹여봤는데 맑은색이아니라 완전히 녹지 못 한 것 같은 뿌연 용액(?)이 되었습니다.

(spin filter를 사용해봤는데, filter 밑으로 다 빠져나가서 투석으로 전환하였습니다. 원인은 찾지 못 했습니다.)

 

일단 aggregation된 것인지 어떤 것인지 확인하려고 SDS-PAGE와 WB을 진행하였습니다.

 SDS-PAGE에서는 target band (10 kD)이외의 impurity band를 확인할 수 있었고 (농축을 한 것인데도 target band는 더 늘어나지 않음),

WB 결과에서는 정제 전과 정제 후에서 target band 와 이의 dimer를 확인하였는데, 투석 후 농축한 sample에서는 dimer가 아니라 Oligmer? (aggregate)를 확인하였습니다.

 

제 target peptide의 solubility의 문제때문에 생긴 침전인 것 같은데,

PBS 이외에 다른 buffer로 녹여서 다시 SDS-PAGE를 진행 후 확인해보아야하는 것인지 잘 모르겠어서 문의드립니다.

아니면 PBS를 더넣고 소니케이션 같은 것으로 aggregate을 풀어줘야하는 것인지요.. ㅠ ㅠ

 

이제 정제 다 했으니까 버퍼 바꾸고 농축 해서 분석 기기로 분석하면 되겠다 ^^ 싶었는데...

이렇게 와장창창창 샘플이 문제가 생길 줄은 몰랐기레 ㅠㅠ

어떻게 해야할지 막막하네요 ㅠㅠ

 

 

항상 감사합니다!

 

#aggregate
 
#dialysis
 
#solubility
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2019.11.29   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

투석을 DW에 진행하셨다는건가요?  이후 투석하고 동결건조를 진행했다는거구요. 그럼 aggregation은 투석과정에서 발생했는데도 동결건조까지 갔다는것인가요?

암튼 투석과정에 salt가 급격히 빠져도 응집이 나타나기도 합니다. 때무에 투석을 할때 그 단백질과 궁합이 맞는 버퍼를 이용하세요. DW에서는 응집을 막기 어려울것입니다.

또 응집된 단백질은 그냥은 풀리지가 않고 urea나 guanidin 을 처리해야 풀립니다. 즉 PSB에 sonication을 진행한다 해서 풀리지가 않습니다.

솔직히 지금 단계에서 aggregation된 단백질을 가지고 해결하기는 힘들것 같고..
정제부터 다시시작하고 imidazol을 뺄때 순차적으로 빼던지, 다른 안정제를 넣던지 아니면 저농도에서 투석을 하던지 방법을 모색해야 할것 같습니다.

단백질 웍을 진행하면서 aggregation은 많은 원인에서 발생합니다. 때문에 단계적으로 천천히 줄여가든 늘려가든 하는게 조건을 잡는데 도움이 될것입니다.

대왕개구리SPEED  |  2019.11.29   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

변성된 단백질은 제거하는 것이 가장 좋습니다.

target 단백질이 변성되어 최종 농도가 줄었습니다.

다시 살리방법이 거의 없습니다.

IEX 시료는 DW로 투석 후 분말화, buffer에 녹이는 것 보다 IEX 평형화 buffer에

바로 투석하는 것이 좋고 아마 DW 투석 보다는 변성되는 target양이 적을거라

생각이 됩니다.

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