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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 RT-PCR을 진행, PCR 특이적 밴드가 뜨지 않습니다.
알구미(대학생)  | 2019.11.28 21:33
첨부파일 파일첨부: (200ng, 500ng, 1000ng).jpg (155 KB)
이미지 첨부파일


RT- PCR을 진행하고 있는 학부생입니다.

RNA 바이러스로부터 RNA를 추출하여 cDNA 그리고 PCR까지과정을 거쳐 전기영동을 통해 샘플을 확인해봤는데 특이적밴드인 444bp가 보이지 않고 맨 아래 밴드만이 보이는 것을 확인할 수 있었습니다. 월초까지만해도 잘만 뜨던 밴드가 갑자기 뜨지 않으니 답답하기만 하네요 많은 선배님들의 답변 부탁드리겠습니다.(ladder는 100bp를 사용했습니다)

 

조건

1. T-25 flask에서 바이러스에 감염된 세포를 거두어 trizol을 이용하여 RNA 추출 -> 펠렛 확인

2. enzynomics사 cDNA 합성 키트를 이용해서 합성진행

 

3. cDNA 농도 및 용량 측정 후 총 cDNA template의 양을 

200ng, 500ng, 1000ng 나누어 takara ex taq을 이용해서 PCR을 진행

 

4. 사진은 농도 및 용량 확인 후 전기영동을 돌린 결과물 입니다.

#RT-PCR
 
#PCR
 
#비특이적 밴드
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2019.11.29   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

잘 되던 실험이니, 예전에 만들어 놓은 cDNA에서 PCR을 진행해 보세요. 거기서도 밴드가 없다면 PCR 실험단계에서 문제가 있는거니까요.

PCR 단계에서 나올수 있는 문제는 primer나 taq 정도가 될것 같습니다.

예전 cDNA에서 잘 나온다면 현재 실험하는 샘플에 cDNA에서 문제가 있을것입니다. 이는 다시 prep해서 cDNA를 만들면 해결될것 같습니다.

그리고 맨아래 밴드는 primer dimer가 아닐까 합니다.

알구미  |  2019.11.29   

답변 감사합니다.

답변 해주신대로 만들어진 cDNA를 가지고 해봐야겠네요

 

그리고 추가적으로 더 궁금한 점이 있는데 

RNA 추출단계에서 DEPC water  또는 DEPC water와 mix 되어진 에탄올70%이 오염되어지는 경우도 있는지 여쭈어 볼 수 있을까요?? 

현재 DEPC water와 70% 에탄올은 15ml tube에 상온시약장에서 보관하고 있습니다.

대왕개구리안재진  |  2019.11.29   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

보통 DEPC water는 상온 보관을 합니다.

오염은 거의 일어나지 않을것 같네요. 그래서 가능성은 0이라 말하기는 어렵겠죠.

알구미  |  2019.11.29   

제가 왜 이러한 문제를 여쭈어 보았냐면 감염세포로부터 RNA를 추출한 후 전기영동을 돌릴시에 28,18s 밴드와 mRNA를 확인할 수 있었는데 보관해두었던 RNA를 전기영동을 돌린 후 보니 RNA가 끌리면서 깨지는 현상을 확인할 수 있었습니다.

그래서 RNA 추출단계에서 사용되는 시약이 문제가 아닌가 싶어서 질문하게 되었습니다. 

RNA는 5일 전 추출후 냉동실에 보관중이었습니다.

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