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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot 질문입니다.
올챙이잉ㅇ이앙(대학생)  |  11.28 14:25

western blot 시 beta actin의 경우 아주 잘 뜨는데, ERK, JNK, p38의 phospho form은 밴드가 너무 희미하게 뜹니다...

1차 항체 농도가 1/1000, 2차 항체 농도가 1/3000인데 1차 항체 농도를 1/500으로 희석해서 진행해도 괜찮을까요??

1차 항체 농도가 1/1000, 2차 항체 농도가 1/3000으로 하였을 때, 이상하게 Ladder만 발광이 되더라구요... 원래 Ladder는 발광이 되지 않는다 들었는데 ㅠㅠ(10번 정도 실험을 했는데 beta actin을 제외하고는 모두 Ladder가 발광이 되었습니다..)

Blocking 및 항체 희석은 모두 Skim milk로 진행합니다.

조언해주시면 감사하겠습니다.

#western blot
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

실험은 제대로 했는데 웨스턴이 잘 안되면 2가지 원인중 한가지가 원인일것입니다.

1. 항체의 활성이 떨어진다. 즉 항체가 똘똘하지 않으면 내 샘플에 항원이 있어도 잘 안잡히겠죠. 해결책은 항체의 농도를 높이거나 항체를 바꾸는 방법이 있습니다.

2. 샘플에 원하는 항원의 농도가 적다. 당연히 샘플에 항원량이 적으면 웨스턴이 잘 안되겠죠...  물론 샘플내에서 항원이 분해되거나 망가져도 이런현상이 나옵니다. 이런 샘플문제라면 positive control을 걸어 확인을 해보면 정확해집니다.

마지막으로 번외 질문은 웨스턴에서 Ladder가 나온다 하면 그건 정말 좋은 Ladder를 사용하거 있거나 혹은 좋지 않은 항체를 사용하면 그럴수 있겠죠... 웨스턴은 항원-항체 반응입니다. 내 타겟 단백질 이외 반응이 된다는건 항체가 똑똑하지 않으니까 나오는 논 스페시픽 반응입니다.

 

대왕개구리안재진  |  11.28 15:35  

웨스턴은 안티바디가 반은 먹고 들어갑니다. ㅋㅋ

사용하고 있는 세포주 어떤 stimulus를 사용했는지 그리고 안티바디는 어디 제품을 사용했는지 알려주시면 조언에 더 큰 도움이 될거 같구요. 

저는 주로 이쪽 signaling 관련 실험은 Cell signaling에서 구매해서 사용합니다. 

https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-p44-42-mapk-erk1-2-thr202-tyr204-antibody/9101

1차 1:1000이면 적당한것으로 생각되구요 2차는 보통 1:5000으로 사용했습니다. 

혹시 사용하고 있는 cell lysate 자체가 phosphorylation이 되지 않을수도 있으니 positive control을 함께 사용하시면 문제 해결에 더 도움이 될수도 있습니다. 

개구리bio  |  12.01 10:51  
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