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과학배우는석사생
(대학원생)
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19.11.25 16:41
원래 나와야 하는 사이즈는 220bp, 240bp 입니다.
lane 별로 220과 240이 어떻게 나오는 것이 정상인가요?
그리고 220과 240의 차이는 무었인가요?
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레벨1
과학배우는석사생
(대학원생)
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19.11.25 17:39
2번레인에서는 220bp 에 해당하는 위치에 band 가 한개만
4번레인에서는 240bp 에 해당하는 위치에 band 가 한개만
떠야하는데, 보시는것처럼 해당위치에 진하게 밴드 그리고 밑에 연하게
다른 밴드가 또 나와있습니다.
220과 240의 target이 다른경우 : primer 문제
220과 240의 target에 중복되는 부분이 있는 경우 : PCR 조건 문제
220과 240의 차이점에 대한 설명이 없네요.
qPCR을 먼저 하지 말고 PCR을 한 후 전기영동 pattern을 확인해 보세요.
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과학배우는석사생
(대학원생)
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19.11.25 19:42
제 추가 설명을 잘못 이해하신 것 같습니다
저의 샘플은 모두 동일하며,
각 Lane 마다 프라이머가 다릅니다!
2번 lane 의 경우 프라이머로 증폭했을 경우 product size 가 220 bp 로 나와야한다는 말이고,
4번 lane 의 경우 해당 프라이머로 증폭시 240 bp 로 떠야한다는 말이었습니다.
한 Lane 당 사용한 Primer 는 1개 씩입니다.
그래서 Band 가 1개씩 떠야한다는 말인데
한 Lane에 보이는 band 가 두개인 것 같아서 고민중입니다 ㅠㅠ
참고하여 피드백 부탁드립니다
문제 해결을 위해 두번째 답변에서 220과 240의 차이를 물었는데
전혀 답을 주지 않기 때문에 가능성을 답할수 밖에 없습니다.
그리고 primer 1개로 PCR이 됩니까?
primer는 2개 또는 1set이 있어야하고 2, 4번 lane에서 정상적으로 기대되는
band pattern을 기준으로 240이 둘다 진하니 primer 문제가 1순위입니다.
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레벨1
BonAppetit
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19.11.26 03:33
혹시 SYBR 으로 qPCR 하셨을것 같은데 멜팅커브를 보셨는지요?
커브가 두개이상이라면 희미한 밴드는 off-target 일것 같네요.
이 경우는 타겟당 프라이머를 하나만 테스트 하지 마시고 2-3개 더 디자인하셔서 해보세요.
사진상으로 보기에 샘플 뿐만 아니라
size marker도 2개씩 보이는데요.
그렇다면, 전기영동을 너무 빨리 전개하지는 않았는지요.
voltage를 낮추어 천천히 해 보세요.
혹시 annealing temp이 얼마나 되나요?
annealing에 문제가 있어서 원래 target하는 부위 말고 다른 부위에 붙어서 off-target이 난 것처럼 보여서요
같은 프라이머로 지금 테스트 해보신 온도보다 2도씩 높여서 2-3개정도 더 해보시는 것도 새로 프라이머 주문하고 걸리는 시간 사이에 한번 시도해보면 좋을 것 같습니다. 아니면 touch down PCR도 좋은 방법일 수 있지만 이렇게 잡은 primer로 q-PCR을 하실꺼면 아마 touch down으로 잡는건 아무의미가 없을 것 같지만요ㅠㅠ
실험 잘 되길 바라겠습니다!
제가보기엔 2번보다 4번레인의 product가 미세하게 약간 높은걸보면
major band가 정상적인 220, 240 product같습니다.
아래 band는 off-target product입니다.
정상적인 PCR의 intensity보다 너무 작다는것이 이를 말해줍니다.
약 1/10-1/5수준으로 증폭이 되네요..
이런경우는 forward나 reverse primer중 하나가 중간에 붙을수 있는 자리가 엉성하게 있을경우 초기 mixture를 만드는 과정에서 증폭되어 최종 product로 나타날때 생길수 있습니다. 최초 mixture만드는 과정을 ice에서 철저히 하시고, PCR machine의 온도를 초기 92-4로 미리 올려놓으시고 pause한후 sample을 탑재하는 등 최대한 off-target product를 줄리려 노력하세요. 또는 hot start Taq을 써도 줄어듭니다. annealing temperature를 조금씩 올려가며 해보세요. gradient줘가며 PCR해서 아랫 band가 없어지는 조건을 잡고 다시 시작하는걸 추천합니다.