실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
바이러스의 개념과 qPCR 실험 관련해 질문이 있습니다.
레벨2 dlsslgl (대학원생)
1. 바이러스는 숙주가 존재하면 생명의 여러 특성을 보이지만 그렇지 않은 환경에서는 스스로 대사 및 복제를 할 수 없는 단백질 덩어리에 불과하기 때문에 반생명으로 분류되어 있습니다. 그러다가 다시 숙주가 생기면 증식을 하구요.
그런데 제가 최근 맡은 연구 과제를 진행하며 공부해보니 titer와 죽은 바이러스, 불활화 바이러스 등 여러 용어들에 대해 알게 되었고, 감염 숙주세포로부터 바이러스를 분리정제한 뒤에는 초저온에서 동결 보존하다가 실험에 사용하기 위해 녹이는 순간부터 바이러스의 활성이 떨어진다고 하더라구요. 그 바이러스 활성은 바로 숙주 감염능력에 영향을 미치고요.
이 점에서 제가 알고 있던 개념이 흔들려서 질문을 드립니다. 제가 알기로 바이러스는 숙주가 없으면, 영양분이 모자란 환경에서의 내생포자처럼 존재하다가 숙주가 생기면 활동을 재개하는 특징을 가지는데, 왜 초저온 냉장고에서 동결보존을 하며, 꺼내서 녹으면 활성과 titer가 급격히 떨어지는지 궁금합니다.
또, 아예 죽은 바이러스와 일시적으로 독성을 약화한 바이러스, 그리고 불활화의 개념 차이에 대해서도 비교해주시면 감사하겠습니다.
2. 저희 연구실에서는 분자생물학적인 연구를 하기 위해 리얼타임 PCR(qPCR)을 많이 진행하는데, 이 qPCR의 절대정량을 위해 농도와 Ct[Cq]값을 아는 스탠다드 DNA 즉 reference(plasmid 안에 삽입된 150bp 가량의 target gene)들을 만들어서 사용합니다.
그런데 이 스탠다드 DNA를 만든 날과 그 다음 날, 심할 때는 만든 지 열시간 정도가 지난 후에도 Ct값이 많이 높아집니다. 저희보다 일찍 졸업한 선배들도 모두 겪었지만 해결책을 마련하지 못해서 매일매일 새로운 스탠다드 DNA를 만들어서 스탠다드만 먼저 테스트 해본 뒤에 qPCR을 진행했다고 합니다.
지금도 이와 같은 방식으로 하고 있고, 왜 벡터 안에 삽입된 DNA의 Cq값이 크게 변하는지에 대해 알아내지 못해서 질문을 드립니다.
벡터는 pMD20Tvector를, DNA를 희석하는 용액은 1x TE버퍼를 사용합니다. 이와 같은 문제를 겪었고 해결하신 분이 계신지, 아니면 이런 문제가 없는 분들의 실험 방법에 대해서 들어보고 싶습니다.
연구를 디자인하고 실험하는 것에 미숙한 대학원생으로서 정중히 질문드립니다. 감사합니다.
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