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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 real time PCR 질문이 있습니다!
앞다리n_jyoung92@naver.com(대학원생)  |  2019.11.21 14:36

안녕하세요. 질문이 PCR 관련해서 질문이 있습니다..

1. DNA합성할 때, 2 ug/ul에 맞춰서 RNA를 넣고 total volume을 20 ul로 맞춰서 합성을 하는데요. 이러면 만들어진 DNA는 100 ng/ul가 되는거고 real time PCR 할 때 0.5 ul 사용하면 적당한 DNA 양을 사용한건가요?

2. 저희 랩실은 template 0.5 uL + 10 pmole/ul 프라이머(sense+antisense) 0.5 uL + RNase free water 4 uL + SYBR 5 uL로 (총 10 uL) real time PCR을 돌립니다. 이 중 프라이머와 water는 미리 섞어놓은 뒤에 사용을 하는데요. 프라이머가 100 pmole/ul로 맞춰 있는 상태에서 sense, anti-sense 각각 5 ul와 RNase free water 890(=45+45+800)uL를 섞어서 사용하면 10 pmole로 희석되면서 맞게 섞인거죠?

3. target gene의 Ct값이 35~38로 높게 나오길래 melting paek을 봤더니 peak가 어떤 샘플은 3개까지도 생기더라구요. 잘 못 했겠지 싶어서 다시 했는데 이렇게 나왔습니다. GAPDH는 17 수준으로 나오고, peak가 하나로 나옵니다. 다른 샘플, 다른 gene으로 했을 때는 Ct값들이 27 내외로 나오길래 찾아보니 적당한 수준인 것 같아서 실험손의 문제보다는 다른 문제가 있지 않을까 싶습니다만 잘 모르겠습니다..

Ct값이 높은 이유를 찾아보니 template 양이 적거나, 프라이머 양이 적거나, 프라이머가 이상(peak가 여러개)하거나, 실험 스킬이 부족하거나 등이 있던데요. 어떤 문제가 가장 클까요..

 

 

#real time PCR
 
#PCR
 
#Ct
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리지나가는사람  |  2019.11.22   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

어떤 kit 를 사용하느냐에 따라 합성양이 다를 수 있습니다.

RNA 를 동일한 양을 썻다해서 cDNA 역시 동일하게 합성된다는 보장이 없습니다.

제 RT-PCR 조건을 예를들면 다음과 같습니다.

Sample 1개당 다음과 같이 진행

cDNA : 1 ul (농도는 실험자에 따라 다름)
FW : 1ul
Rev : 1ul
SYBR : 10ul

DW : 7ul

Primer 희석은 다음과 같이 진행

100pm --------> 10pm
= 990ul of DW + 10ul of 100pm primer (FW, Rev)

그리고 CT 값은 sample(조직 or 세포) 의 양과 상태에따라 많은 차이가 있습니다.

또한 만약 ct 값이 높다면 primer 양을 절반으로 줄여보는 것도 방법입니다.

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