실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
real time PCR 질문이 있습니다!
레벨5 n_jyoung92@naver.com (대학원생)
안녕하세요. 질문이 PCR 관련해서 질문이 있습니다..
1. DNA합성할 때, 2 ug/ul에 맞춰서 RNA를 넣고 total volume을 20 ul로 맞춰서 합성을 하는데요. 이러면 만들어진 DNA는 100 ng/ul가 되는거고 real time PCR 할 때 0.5 ul 사용하면 적당한 DNA 양을 사용한건가요?
2. 저희 랩실은 template 0.5 uL + 10 pmole/ul 프라이머(sense+antisense) 0.5 uL + RNase free water 4 uL + SYBR 5 uL로 (총 10 uL) real time PCR을 돌립니다. 이 중 프라이머와 water는 미리 섞어놓은 뒤에 사용을 하는데요. 프라이머가 100 pmole/ul로 맞춰 있는 상태에서 sense, anti-sense 각각 5 ul와 RNase free water 890(=45+45+800)uL를 섞어서 사용하면 10 pmole로 희석되면서 맞게 섞인거죠?
3. target gene의 Ct값이 35~38로 높게 나오길래 melting paek을 봤더니 peak가 어떤 샘플은 3개까지도 생기더라구요. 잘 못 했겠지 싶어서 다시 했는데 이렇게 나왔습니다. GAPDH는 17 수준으로 나오고, peak가 하나로 나옵니다. 다른 샘플, 다른 gene으로 했을 때는 Ct값들이 27 내외로 나오길래 찾아보니 적당한 수준인 것 같아서 실험손의 문제보다는 다른 문제가 있지 않을까 싶습니다만 잘 모르겠습니다..
Ct값이 높은 이유를 찾아보니 template 양이 적거나, 프라이머 양이 적거나, 프라이머가 이상(peak가 여러개)하거나, 실험 스킬이 부족하거나 등이 있던데요. 어떤 문제가 가장 클까요..
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