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질문 vector prep할 때 EtOH PPT 하면 잘려요... 도와주세요
올챙이pje(일반인)  | 2019.11.20 22:04
첨부파일 파일첨부: 20191120-1.tif (348 KB)

pGEX-2T vector를 BamHI으로 enzyme digestion 후, AP 처리하고, gel extraction 했을 때 까지는 ~4900 bp 밴드만 확인이 됐는데, 

Phenol-Chloroform extraction 후 EtOH 침전을 한 후에는 첨부된 사진 처럼 ~4900 bp 밴드와 ~2300 bp 밴드 두개가 보입니다. 거의 크기가 절반정도로 줄어든 size의 밴드가 보이는데 왜 그러는 걸까요??  도와주세요...

Phenol-Chloroform extraction 후 EtOH 침전은 다음과 같은 방법으로 진행했습니다.

5M NaCl 1/10 vol. 첨가, Phenol 1/2 vol. 첨가, Chloroform 1/2 vol. 첨가

-> vortex

->15000 rpm, RT, 5 min centrifuge

-> save upper phase and Chloroform 1 vol. 첨가

-> vortex

->15000 rpm, RT, 5 min centrifuge

-> save upper phase and 100% EtOH 2 vol. 첨가

->-20 ºC, 2 h

->15000 rpm, 4 ºC, 15 min centrifuge

-> Decant suppernatant, 70 % EtOH 500 ul add

-> vortex

->15000 rpm, 4 ºC, 5 min centrifuge

-> Decant suppernatant, air dry

-> Add nuclease free water

#에탄올침전
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.11.20   

elution 전 제한효소만 처리한 사진은 없나요?

정제 방법은 별로 문제될만 한 점은 없어 보입니다.

vortex를 하는 단계를 inverting으로 바꿔서 해보세요.

아니면 phenol을 처리하지 말고 BanHI과 AP를 열로 실활시킨 후 EtOH down만

해서 사용해도 됩니다.

heat inactivation condition : 75oC for 10min

올챙이pje  |  2019.11.20   
첨부파일 파일첨부: 20191111-6.tif (284 KB)

답변 감사드립니다. 

 

첨부된 사진에서 왼쪽부터 size marker (lamda Hind III), pGEX-2T-BamHI-AP-gel extraction 1/2, pGEX-2T-BamHI-AP-gel extraction 2/2, insert prep 입니다.

 

에탄올 침전 하기 전에 gel extraction 한 후 상태입니다.

vector는 질문등록할 때 첨부한 전기영동 사진의 순서와 동일한 순서로 loading되어있습니다.

 

에탄올 침전 하기 전의 vector로 cloning 해 봤는데, transformant가 안 떠서 에탄올 침전을 했는데, 잘려버렸어요...ㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  2019.11.20   

gel extraction 후에 밑의 band가 보이네요..

자르기 전의 vector는 어디쯤에 나오나요?

올챙이pje  |  2019.11.20   
첨부파일 파일첨부: 20191114-1.tif (440 KB)

이 size가 자르기 전의 empty vector size 입니다.

올챙이pje  |  2019.11.20   
첨부파일 파일첨부: 20191111-3.tif (306 KB)

이 사진은 BamHI 처리하고 gel extraction 하기 전의 상태입니다.

올챙이pje  |  2019.11.20   
첨부파일 파일첨부: 20191111-5.tif (518 KB)

Enzyme digestion하고 gel extraction 한 이후에

왼쪽 sample에는 ~2300 bp 밴드가 희미하게 보이는데, 오른쪽 sample에는 안 보여서 cloning은 오른쪽 sample로만 했는데 잘 안 됐습니다.

 

~2300 bp 밴드가 EtOH 침전 후에 확 증가했는데, 이게 왜 그런지 잘 이해가 안됩니다...ㅜㅜ 

 

새로 첨부한 사진은 gel extraction 하기 위해서 loading 한 사진인데, ~4900 bp 밴드만 잘라냈는데 첫번째 sample에서는 왜 희미하게 ~2300 bp 밴드가 보일까요?

 

대왕개구리SPEED  |  2019.11.20   

1. clonig이 잘 안됐다는 것이 positive clone이 안나온건가요 아니면 colony가

하나도 안나온건가요?

2. gel elution을 하기 위한 전기영동이 너무 짧게 내렸습니다.

훨씬더 내려서 elution하세요.

전기영동에서 보이는 것 보다 여러 band가 혼합되어 있습니다.

1차 elution한것을 2차 elution해도 cloning할 양은 충분할것 같습니다.

3. 이런 현상으로 cloning이 안될 이유는 없을 것 같습니다.

vector, insert도 잘 준비된 것 같습니다.

전체적으로 볼때 vector가 잘린것이 아니라 원래있던 band가 혼입되어 나타난

현상이며 2차 elution을 하는 것이 좋을 듯 합니다.

2차 elution후 vector와 insert를 ligation 후 반드시 전기영동을 해서 ligation 효율

을 확인 한 후 TF하면 좋을 것 같습니다.

CP cell 효율에 문제가 없는지 미리 확인해 두면 좋습니다.

 

 

올챙이pje  |  2019.11.21   

Transformant가 하나도 안 떴습니다. ㅜㅜ

 

EtOH extraction 한 sample (4900 bp + 2300 bp 섞여있는 sample)을 

Gel extraction을 다시 하라는 말씀이시죠?

다시 해 보겠습니다!

그리구 gel extraction 해서 column으로 정제 후에 바로 EtOH ppt 안 하고 바로 ligation 해도 잘 되어야 하는거죠?

Competent cell은 empty plasmid ~10 ng정도를 CP cell 10 ul과 반응시키면 수천개 transfomant가 나올 정도로 잘 됩니다. (HIT DH5a, RBC-RH617 구매해서 사용중입니다.)

 

한 가지 이해가 안 되는 점은 원래 있던 작은 밴드가 혼입되어 나타나는 거라고 하셨는데, 작은 밴드의 양은 EtOH ppt 전보다 후에 양이 더 많아진 것으로 확인이 되는 것 같은데 이유가 뭘까요?

 

그리구 size가 linear vector size의 1/2 정도의 밴드가 나오는데, 혹시 double strand가 single strand로 깨졌을 가능성은 없는 건가요?

 

대왕개구리SPEED  |  2019.11.21   

1. colony가 하나도 안나왔고 CP cell에 문제가 없으면 ligation 문제를 확인해

볼 필요가 있습니다.

2. re-elution은 1차 elution한 4900 bp + 2300 bp 섞여있는 sample을 다시 elution

하면 됩니다.

최대한 길게 전기영동을 내려서 elution해 보세요.

3. gel extraction 해서 column으로 정제 후에 바로 EtOH ppt 안 하고 바로

ligation 해도 잘 되어야 하는거죠?

: 네.. 맞습니다.. 하지만 항상 ligation 후 mixture를 전기영동해서 확인하는 것이

좋습니다.

4. Competent cell은 empty plasmid ~10 ng정도를 CP cell 10 ul과 반응시키면

수천개 transfomant가 나올 정도로 잘 됩니다.

: CP cell은 문제없는 것 같습니다.

5. 원래 있던 작은 밴드가 혼입되어 나타나는 거라고 하셨는데, 작은 밴드의

양은 EtOH ppt 전보다 후에 양이 더 많아진 것으로 확인이 되는 것 같은데

이유가 뭘까요?

: 앞의 답변에서 설명했듯이 1차 elution할 때 전기영동 거리가 너무 짧게

내리면 여러 form의 vector가 혼입됩니다.

분명히 single band를 잘라서정제했는데 전기영동 해보면 band가 2개 나오는

경우가 종종 있습니다.

elution 할때는 전기영동을 최대한 길게 내린 후 잘라내는 것이 좋습니다.

6. size가 linear vector size의 1/2 정도의 밴드가 나오는데, 혹시 double strand가

single strand로 깨졌을 가능성은 없는 건가요?

: 가능성은 0이지만 만의 하나 그런 현상이 생겨도 실온에서는 ss DNA는 바로

상보적 결합을 해서 dsDNA로 순간적으로 전환됩니다.

그런 걱정은 안해도 됩니다.

올챙이pje  |  2019.11.21   
첨부파일 파일첨부: 20191121-2.tif (569 KB)

gel extraction 하기 위해서 loading 한 사진입니다.

0.8 % agarose gel에 0.5 X TAE buffer에서 50 min loading 하였습니다.

(Bromophenol blue dye가 빠지기 직전까지 loading 했습니다.

 

올챙이pje  |  2019.11.21   
첨부파일 파일첨부: 20191121-3.tif (161 KB)

Gel extraction 한 후(40 ul로 elution 했습니다.)

sample을 2 ul loading한 사진입니다.

작은 밴드 안 보이게 잘 정제가 된 것 처럼 보입니다.

Nano-Vue 정량 결과

23 ng/ml, A260/A280 : 1.804, A260/A230 : 1.022 이렇게 나왔습니다.

Salt가 정제가 잘 안 된 것 같아서 EtOH ppt 다시 해 보려고 합니다.

또 작은 밴드가 생기지는 않겠죠?ㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  2019.11.21   

잘 elution하셨네요.

그런데 농도가 23ng/ml이 나왔다구요?

계산을 잘못했을 겁니다.

elution할때는 항상 길게 내려서 실험하는 것이 좋습니다.

이 vector를 사용해서 insert와 ligation 후 반드시 전기영동으로 확인해 보세요.

ligation이 잘되었으면 100% cloning에 성공할겁니다.

elution했으면 바로 사용해도 되고 salt가 거의 없습니다.

정제를 하면 수율이 내려갑니다.

처음부터 elution 할 때 혼입된 band가 제거 되었기 때문에 새로운 band가 생기는

일은 없을겁니다.

올챙이pje  |  2019.11.21   

앗 죄송합니다! 23 ng/ ul이 나왔어요!

올챙이pje  |  2019.11.21   
첨부파일 파일첨부: 20191121-4.tif (165 KB)

EtOH ppt 안 해도 되겠다는 답변을 EtOH 넣어버리고 나서 확인을 해서

EtOH ppt 진행을 했습니다.

그런데 또 작은 밴드가 튀어나왔어요.....

이번에는 EtOH ppt 하기 전에 A260/A280이 1.8이기도 하고 

enzyme 반응 시킨 것 없이 gel extraction을 해서 

phenol/chloroform extraction은 하지 않고 바로 EtOH ppt를 했습니다.

그래서 phenol이 산화돼서 DNA를 손상시켰다거나 

phenol 추출 할 때 vortex를 너무 세게 했다거나 하는 문제는 아닌 것 같습니다.

정말 이상한 것이 insert prep 할 때도 똑같은 stock을 써서 EtOH ppt를 하는데, 이렇게 작은 밴드가 생기는 문제가 일어나지 않습니다.

뭐가 문제일까요? ㅜㅜㅜㅜㅜ

꽃개구리느림보  |  2019.11.22   

예상크기와 다른 밴드가 나온 이유는 BamHI의 star activity가 원인일 겁니다. 

BamHI은 열로 불활성화가 잘 안됩니다. 또 컬럼으로 정제를 하더라도 약간의 활성이 따라다닐 가능성을 무시하기 어렵습니다. 잘려진 밴드의 DNA는 걱정하지 말고 그냥 그대로 클로닝을 진행하면 괜찮을 거예요. 

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