elution 전 제한효소만 처리한 사진은 없나요?
정제 방법은 별로 문제될만 한 점은 없어 보입니다.
vortex를 하는 단계를 inverting으로 바꿔서 해보세요.
아니면 phenol을 처리하지 말고 BanHI과 AP를 열로 실활시킨 후 EtOH down만
해서 사용해도 됩니다.
heat inactivation condition : 75oC for 10min
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19.11.20 23:06
답변 감사드립니다.
첨부된 사진에서 왼쪽부터 size marker (lamda Hind III), pGEX-2T-BamHI-AP-gel extraction 1/2, pGEX-2T-BamHI-AP-gel extraction 2/2, insert prep 입니다.
에탄올 침전 하기 전에 gel extraction 한 후 상태입니다.
vector는 질문등록할 때 첨부한 전기영동 사진의 순서와 동일한 순서로 loading되어있습니다.
에탄올 침전 하기 전의 vector로 cloning 해 봤는데, transformant가 안 떠서 에탄올 침전을 했는데, 잘려버렸어요...ㅜㅜ
gel extraction 후에 밑의 band가 보이네요..
자르기 전의 vector는 어디쯤에 나오나요?
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19.11.20 23:21
이 size가 자르기 전의 empty vector size 입니다.
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19.11.20 23:23
이 사진은 BamHI 처리하고 gel extraction 하기 전의 상태입니다.
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19.11.20 23:27
Enzyme digestion하고 gel extraction 한 이후에
왼쪽 sample에는 ~2300 bp 밴드가 희미하게 보이는데, 오른쪽 sample에는 안 보여서 cloning은 오른쪽 sample로만 했는데 잘 안 됐습니다.
~2300 bp 밴드가 EtOH 침전 후에 확 증가했는데, 이게 왜 그런지 잘 이해가 안됩니다...ㅜㅜ
새로 첨부한 사진은 gel extraction 하기 위해서 loading 한 사진인데, ~4900 bp 밴드만 잘라냈는데 첫번째 sample에서는 왜 희미하게 ~2300 bp 밴드가 보일까요?
1. clonig이 잘 안됐다는 것이 positive clone이 안나온건가요 아니면 colony가
하나도 안나온건가요?
2. gel elution을 하기 위한 전기영동이 너무 짧게 내렸습니다.
훨씬더 내려서 elution하세요.
전기영동에서 보이는 것 보다 여러 band가 혼합되어 있습니다.
1차 elution한것을 2차 elution해도 cloning할 양은 충분할것 같습니다.
3. 이런 현상으로 cloning이 안될 이유는 없을 것 같습니다.
vector, insert도 잘 준비된 것 같습니다.
전체적으로 볼때 vector가 잘린것이 아니라 원래있던 band가 혼입되어 나타난
현상이며 2차 elution을 하는 것이 좋을 듯 합니다.
2차 elution후 vector와 insert를 ligation 후 반드시 전기영동을 해서 ligation 효율
을 확인 한 후 TF하면 좋을 것 같습니다.
CP cell 효율에 문제가 없는지 미리 확인해 두면 좋습니다.
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19.11.21 00:56
Transformant가 하나도 안 떴습니다. ㅜㅜ
EtOH extraction 한 sample (4900 bp + 2300 bp 섞여있는 sample)을
Gel extraction을 다시 하라는 말씀이시죠?
다시 해 보겠습니다!
그리구 gel extraction 해서 column으로 정제 후에 바로 EtOH ppt 안 하고 바로 ligation 해도 잘 되어야 하는거죠?
Competent cell은 empty plasmid ~10 ng정도를 CP cell 10 ul과 반응시키면 수천개 transfomant가 나올 정도로 잘 됩니다. (HIT DH5a, RBC-RH617 구매해서 사용중입니다.)
한 가지 이해가 안 되는 점은 원래 있던 작은 밴드가 혼입되어 나타나는 거라고 하셨는데, 작은 밴드의 양은 EtOH ppt 전보다 후에 양이 더 많아진 것으로 확인이 되는 것 같은데 이유가 뭘까요?
그리구 size가 linear vector size의 1/2 정도의 밴드가 나오는데, 혹시 double strand가 single strand로 깨졌을 가능성은 없는 건가요?
1. colony가 하나도 안나왔고 CP cell에 문제가 없으면 ligation 문제를 확인해
볼 필요가 있습니다.
2. re-elution은 1차 elution한 4900 bp + 2300 bp 섞여있는 sample을 다시 elution
하면 됩니다.
최대한 길게 전기영동을 내려서 elution해 보세요.
3. gel extraction 해서 column으로 정제 후에 바로 EtOH ppt 안 하고 바로
ligation 해도 잘 되어야 하는거죠?
: 네.. 맞습니다.. 하지만 항상 ligation 후 mixture를 전기영동해서 확인하는 것이
좋습니다.
4. Competent cell은 empty plasmid ~10 ng정도를 CP cell 10 ul과 반응시키면
수천개 transfomant가 나올 정도로 잘 됩니다.
: CP cell은 문제없는 것 같습니다.
5. 원래 있던 작은 밴드가 혼입되어 나타나는 거라고 하셨는데, 작은 밴드의
양은 EtOH ppt 전보다 후에 양이 더 많아진 것으로 확인이 되는 것 같은데
이유가 뭘까요?
: 앞의 답변에서 설명했듯이 1차 elution할 때 전기영동 거리가 너무 짧게
내리면 여러 form의 vector가 혼입됩니다.
분명히 single band를 잘라서정제했는데 전기영동 해보면 band가 2개 나오는
경우가 종종 있습니다.
elution 할때는 전기영동을 최대한 길게 내린 후 잘라내는 것이 좋습니다.
6. size가 linear vector size의 1/2 정도의 밴드가 나오는데, 혹시 double strand가
single strand로 깨졌을 가능성은 없는 건가요?
: 가능성은 0이지만 만의 하나 그런 현상이 생겨도 실온에서는 ss DNA는 바로
상보적 결합을 해서 dsDNA로 순간적으로 전환됩니다.
그런 걱정은 안해도 됩니다.
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19.11.21 17:30
gel extraction 하기 위해서 loading 한 사진입니다.
0.8 % agarose gel에 0.5 X TAE buffer에서 50 min loading 하였습니다.
(Bromophenol blue dye가 빠지기 직전까지 loading 했습니다.
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19.11.21 17:34
Gel extraction 한 후(40 ul로 elution 했습니다.)
sample을 2 ul loading한 사진입니다.
작은 밴드 안 보이게 잘 정제가 된 것 처럼 보입니다.
Nano-Vue 정량 결과
23 ng/ml, A260/A280 : 1.804, A260/A230 : 1.022 이렇게 나왔습니다.
Salt가 정제가 잘 안 된 것 같아서 EtOH ppt 다시 해 보려고 합니다.
또 작은 밴드가 생기지는 않겠죠?ㅜㅜ
잘 elution하셨네요.
그런데 농도가 23ng/ml이 나왔다구요?
계산을 잘못했을 겁니다.
elution할때는 항상 길게 내려서 실험하는 것이 좋습니다.
이 vector를 사용해서 insert와 ligation 후 반드시 전기영동으로 확인해 보세요.
ligation이 잘되었으면 100% cloning에 성공할겁니다.
elution했으면 바로 사용해도 되고 salt가 거의 없습니다.
정제를 하면 수율이 내려갑니다.
처음부터 elution 할 때 혼입된 band가 제거 되었기 때문에 새로운 band가 생기는
일은 없을겁니다.
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19.11.21 17:57
앗 죄송합니다! 23 ng/ ul이 나왔어요!
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19.11.21 23:16
EtOH ppt 안 해도 되겠다는 답변을 EtOH 넣어버리고 나서 확인을 해서
EtOH ppt 진행을 했습니다.
그런데 또 작은 밴드가 튀어나왔어요.....
이번에는 EtOH ppt 하기 전에 A260/A280이 1.8이기도 하고
enzyme 반응 시킨 것 없이 gel extraction을 해서
phenol/chloroform extraction은 하지 않고 바로 EtOH ppt를 했습니다.
그래서 phenol이 산화돼서 DNA를 손상시켰다거나
phenol 추출 할 때 vortex를 너무 세게 했다거나 하는 문제는 아닌 것 같습니다.
정말 이상한 것이 insert prep 할 때도 똑같은 stock을 써서 EtOH ppt를 하는데, 이렇게 작은 밴드가 생기는 문제가 일어나지 않습니다.
뭐가 문제일까요? ㅜㅜㅜㅜㅜ
예상크기와 다른 밴드가 나온 이유는 BamHI의 star activity가 원인일 겁니다.
BamHI은 열로 불활성화가 잘 안됩니다. 또 컬럼으로 정제를 하더라도 약간의 활성이 따라다닐 가능성을 무시하기 어렵습니다. 잘려진 밴드의 DNA는 걱정하지 말고 그냥 그대로 클로닝을 진행하면 괜찮을 거예요.