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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 gDNA 시퀀싱
알YKim(과기인)  |  2019.11.20 05:40

특정 gene이 insertion된 뮤턴트 스트레인을 하나 가지고 있습니다. 이 gene 앞뒤로 수백 bp정도를 통채로 들어내야 하는데, 시퀀스를 알고 싶습니다. GeneBank에는 당연히 등록되어 있지 않습니다.

 

특정 gene 내부의 시퀀스를 이용해서 프라이머를 짠 뒤 PCR하여 그 프로덕트를 시퀀싱해도 될것 같은데, 여기서 문제가 생깁니다. Forward 프라이머는 gene 내부 시퀀스로 짜겠지만, reverse 프라이머는 짤 방법이 없네요.  할수 없이 포워드 프라이머만으로 PCR하게 되면 밴드가 3-5개씩 나옵니다. 억지로라도 싱글밴드 만들어서 시퀀싱하는게 정석인지요? 결국 ssDNA가 프로덕트로 될텐데, 이게 시퀀싱 보내다가 다 망가질 듯 합니다.

어찌어찌 하여 시퀀싱을 보낸다고 한다면, forward PCR 프라이머보다 좀 더 3' 쪽에 위치한 시퀀스로 시퀀싱용 프라이머를 새로이 만들어서 시퀀싱해야 하는건가요?

 

혹은 다른 방법이 있는지요?

 

감사합니다. -_-

#시퀀싱
 
#gDNA
 
#크로모좀
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.11.20   

forward라도 specific하다면 primer walking 방법으로 sequncing하면 됩니다.

꽃개구리느림보  |  2019.11.22   

inverse PCR이면 될 것 같습니다. 적당한 제한효소로 자르고 DNA ligase로 self circle을 만든 후 바깥쪽 방향으로 배치된 프라이머로 PCR을 하는 겁니다. 

genome walking 키트제품들도 고려해 볼 수 있고요. 

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