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질문 MBP 정제 시 예상 size와 다른 크기의 진한 밴드
올챙이Olajucan(대학원생)  |  2019.11.15 22:33
첨부파일 파일첨부: 그림1.png (276 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요.

pMAL-c5x vector를 이용하여 MBP fusion 단백질 발현 및 정제를 하고 있는데요.

사진의 빨간색 박스와 같이 제가 원하는 사이즈의 단백질은 발현이 된 것 같은데, amylose resin으로 정제를 하면 그보다 작은 곳에서 진한 band가 나오네요.

혹시 이런 현상을 겪으신 분이 있는지 질문드립니다.

정제가 잘못 된건지, 혹은 발현부터 잘 안된건지 모르겠습니다.

감사합니다.

#단백질 발현
 
#MBP
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.11.16   

위의 target과 아래에 나온 band는 분자량이 얼마나 되나요?

그리고 target 단백질의 native MW는 얼마나 되나요?

아래에 나온 band도 soluble fraction에서 양이 많이 보입니다.

이런 종류의 정제 실험은 항상 전기영동을 FT, washing, elution fraction을 최대한

적은 volume으로 여러개 받아서 각 fraction을 전기영동해야 합니다.

각 fraction의 전기영동 사진을 보면 target 단백질을 찾을 수가 있습니다.

올챙이Olajucan  |  2019.11.16   

안녕하세요. 댓글 감사드립니다.

위의 표시 부분은 75 kDa, 진한 밴드 부분은 45 kDa 정도입니다.

MBP fusion이 안된 제 단백질의 예상 크기가 43 kDa정도 되고, MBP size가 대략 40정도로 fusion 단백질의 크기를 80 kDa로 예상했습니다.

감사합니다.

대왕개구리SPEED  |  2019.11.16   

발현 서열에 문제는 없습니까?

발현 서열에 문제가 없으면 FT와 washing fraction을 전기영동 해서 traget이

어디에서 나오는지 확인해 보세요.

올챙이Olajucan  |  2019.11.16   

네 그렇게 진행해 보겠습니다.

다시 한번 감사드립니다. ^^

대왕개구리강시  |  2019.11.16   

오래 전, MBP 벡터에 유전자를 퓨전해서 발현시켰던 적이 있었습니다.

염기서열도 확인했고 파일럿 스케이일로 재조합 단백질의 발현도 (양이 적기는 했지만) 확인했습니다.

문제는 대량배양해서 정제를 하면 재조합 퓨전 단백질은 소량만 정제되고 MBP 크기의 단백질만 잔뜩 정제돠었습니다.

아마도 발현된 단백질이 대장균내에서 절단되서 그런게 아닌가 싶습니다.

이런 현상은 GST 퓨전 벡터에서는 아주 자주 발생합니다.

 

님의 젤사진을 보면 soluble fraction에 있던 단백질(아마도 퓨전 단백질인 것으로 보이는)이 정제하면 농도도 흐려지고 MBP 크기의 단백질만 잔뜩 정제되고 있습니다. 이 단백질이 아마도 제가 경험했던 그런 절단된 MBP가 아닌가 싶습니다.

 

또 하나 이상한 것은 어째서 soluble fraction과 insoluble의 밴드 패턴이 거의 같아 보이죠?

 

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