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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot 실험시, 항체 반응 후 ponceau S staining
알대학원생94(대학원생)  |  11.15 15:42
첨부파일 파일첨부: ponceau s staining.PNG (69 KB)
이미지 첨부파일

western blot 실험 과정 중 결과에 대해서 여쭙고자 합니다.

PVDF membrane을 이용해서 transfer 하고 바로 항체 반응 진행했고, 그 후 chemiluminescence 과정까지 진행했습니다.
그 후에 membrane을 그대로 ponceau S 로 stain을 해봤습니다.  
결과는 첨부파일로 확인해주시면 됩니다.
(lane 1: marker, lane 2: 단백질1, lane 3: 단백질2, lane 4: 단백질3)

사진 결과를 보면 lane 3과 4에서 염색된 두꺼운 밴드가 보이는데, 이 밴드가 항체에 반응한 단백질 부분이라고 볼 수 있을까요? 그러면 다른 밴드가 안보이는 것은 항체 반응하지 않은 부분은 염색이 되지 않았다는 걸까요?

transfer 직후에 staining을 한것이 아니기때문에 다른 결과가 나올것이라 예상은 했지만,
어떻게 해석해야할지 모르겠어서 질문 드립니다.

 

감사합니다. 

#western blot
 
#ponceau S
 
#membrane
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chemiluminescence 측정한 사진과 비교해보면 알수 있습니다.

첨부 사진을 색상 조절해 보면 lane 2, 3, 4에서 염색된 단백질이 여러개 보입니다.

background 색으로 인해 잘 안보이는 것 뿐입니다.

대왕개구리SPEED  |  11.15 16:23  
웨스턴을 하면 미량의 항체가 타겟 단백질에 붙습니다.
그래서 멤브레인을 염색해도 항체가 붙었는지 알기는 어렵습니다.
웨스턴을 한 다음 폰슈로 염색하면 블라킹에 사용한 BSA나 스킴밀크 단백질이 멤브레인 전체에 그야말로 도배를 한 상태라서 멤브레인 전체가 빨갛게 염색됩니다.
그래서 젤이 빨갛게 보이는 것이며 단백질 밴드가 보이는 것은 원래 있는 만큼만 보이는 것이며 항체가 붙었는지는 말해주지 않습니다.
대왕개구리강시  |  11.15 21:13  

강시님 말씀처럼

Blocking한 membrane에는
membrane전체에 blocking protein이 달라붙어있으므로 

ponceau s 염색이 의미가 없습니다.
 

개구리무광  |  11.16 03:54  
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