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모기 ITS2 분자적 동정 관련 PCR실험 관련 질문입니다.
레벨1 캐논플라이 (대학원생)
안녕하세요. 모기 ITS2 부분에 대하여 실험 과정중 막히는 부분이 있어 질문드립니다.
ITS2 부분에 대하여 근연종끼리 forward primer는 동일하게 하고 reverse primer에 대해 종끼리 차이가 나는 부분에 대해 다르게 설계하여 분자적 종 진단 실험에 관해 진행중에 있습니다.
총 5가지 종에 대해 specific reverse primer를 짰고, 실험을 진행한 결과 1종을 제외하고 나머지 4종은 잘나왔습니다. mixture reagents는 forward 프라이머 포함, 5종 reverse primer를 모두 첨부하였습니다.
ladder 부분 오른쪽 두 샘플이 밴드가 뜨질 않았습니다. 위 사진은 annealing tm값을 50도 놓고 진행하였습니다.
그래서 저 2가지 샘플에 대해서만 mixture를 만들어서 동일한 조건에 PCR하여 전기영동 실험을 진행하였습니다. mixture reagents는 다른 프라이머들은 제외하고 forward와 저 샘플에 대해서 specific한 프라이머 1개만 넣었습니다. (동일한 온도, 동일 사이클)
그 결과, 실험했을때 원하는 부위에 밴드가 뜬 것을 확인했습니다.
whole mixture를 만들었을때는 샘플에 대해 원하는 밴드가 뜨지않고, 단독으로 진행했을때 밴드가 뜨는 이유를 알 수 있을까요? 어떻게 실험을 수정해야할지도 조언해주시면 감사하겠습니다. 손 차이인가 싶어 여러번 실험을 수행해도 단독으로 진행했을때는 밴드가 뜨고, 모든 프라이머를 섞은 실험에서는 밴드가 뜨질 않습니다. 현재로는 프라이머가 약해서 그런게 아닐까 생각하고는 있는데.. MgCl값을 바꿔도 보고, Tm값도 51도 53도로 진행도 해봤는데 여전히 잘 뜨질 않습니다. 글 봐주셔서 감사합니다.
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