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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 cDNA PCR size 질문드립니다. 사진첨부합니다.
알밀크시슬(대학생)  |  11.11 23:20

지난번에 cDNA PCR관련 질문을 드렸던 글쓴이입니다.

현재 Cloning을 진행하기 위해 cDNA상에서 PCR을 진행하고 있으며, 어려움이 있어 조언을 구하고자합니다. 

upload_image

(Leader를 기준으로 좌측부터 A B C D)

예상되는 size로는 B: 614 bp / C: 754 bp / D:679 bp입니다.

우선, B를 1band로 보고 Purification을 진행해도 될지 여쭤보고자 합니다.

또한 C, D를 gel elution을 통해 실험을 진행하고자하는데, multiband가 보여질 뿐만 아니라, 제가 원하는 size보다 크거나 더 선명한 Band들이 있는데 어떠한 부분을 이용해야할지 고민입니다.

 

PCR시 enzyme으로는 etaq를 사용하였으며, PCR조건으로는 95도 3분

95도 30초, 어닐링 온도 30초, 72도 1분 X35Cyxle과 72도 5분을 주었습니다.

 

upload_image

이후 PCR조건을 변경하여 Pfu Ennzyme을 진행하였고, 

95도 1분, 어닐링 온도 1분 , 72도 2분 X35Cyxle을 한 사진입니다.

이때 Pfu PCR을 통해 얻은 Product를 가지고 cloning을 진행하여도 괜찮을까요??

 

+)cDNA에서 PCR을 진행하기 위해 Primer를 여러번 제작해보고, 어닐링 온도를 비롯한 PCR조건을 바꾸어 실험해도 잘 되지않네요.....어려움이 많습니다 ㅜ 조언해주시면 감사하겠습니다. (gDNA에서 진행하기엔 size가 너무 크고 Intron사이의 길이가 너무 길뿐만아니라 명확한 Description이 없어 실험에 어려움이 있습니다..)

#cDNA
 
#PCR
 
#gel사진
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
이런 문제는 먼저 primer seq 를 바꿔보는게 좋습니다.
가장 많이 선택하는 방법이죠.
그게 불가능하면 gDNA에서 증폭하는 방법을 사용합니다.
인트론이 있으면(길이가 600-800 이니 인트론이 아마 하나일텐데...) 엑손을 각각 증폭하되 각 엑손의 말단부위가 겹치게 프라이머를 디자인하면 됩니다.
각 엑손을 증폭하고 증폭된 PCR products를 섞어서 두번째 증폭하면 됩니다.
대왕개구리강시  |  11.12 03:26  
원치 않는 잡밴드가 많이 만들어져도 맞는 크기 밴드를 elution해서 이차 피시알을 하면 됩니다.
이때, PCR로 얻은 DNA를 제한효소로 잘라봐서 맞게 잘리면 (또는 sequence 를 확인해서) 실험을 진행하면 됩니다.
대왕개구리강시  |  11.12 03:30  

PCR 치고는 상당히 조건이 안잡힌 결과입니다.

primer를 다시 디자인하는것이 좋을 듯합니다.

대왕개구리SPEED  |  11.12 09:23  

이미 많은 분들이 답변을 다셨지만..

 

우선 가장 먼저 의심되는 것은 cDNA용 Primers 디자인이 좋지 않다는 것입니다. 많은 사람들이 간과하고 넘어가는 것이 요즘은 프라이머 디자인을 소프트웨어로 하다보니 당연히 좋을 것이라 생각하고 검증의 단계를 거치지 않습니다. 그러다보면 디자인된 프라이머가 특이성이 별로 없어서 여러 곳에 붙을 수 있게 되고 결국 결과는 멀티 밴드가 나오게 되죠. 디자인된 프라이머의 seq.를 blast에서 돌려보셨는지요? 아마 여기에서 검색해보면 굉장히 유사한 seq.를 가진 부분들이 많이 나올 것으로 생각됩니다. 

 

두번 째는 프라이머의 seq.를 검색해봤더니 조금 유사한 부분들이 발견되기는 하지만 사용할 수 있을 정로로는 잘 나온 것 같음에도 불구하고 자꾸 멀티 밴드가 뜨는 경우입니다. 이럴 때는 PCR 조건이 굉장히 잘못 잡힌 경우라고 볼 수 있습니다. MgSO4 농도, align 온도 등에 의해 여러 결과가 나올 수 있습니다. 

알기억상실  |  11.12 09:48  

클로닝이나 2차 실험이 이어져 있다면, pfu나 또는 Hot Start Taq.을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 pfu는 fidelity가 높을 뿐이지 잘못 디자인된 프라이머로 인해 나오는 멀티 밴드를 줄여주지는 않습니다. 멀티 밴드를 줄여주는 데는 Hot Start Taq.이 많은 도움이 될 수 있습니다.

 

좋은 결과 얻으시길 바랍니다.

알기억상실  |  11.12 09:50  
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