실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
cDNA PCR size 질문드립니다. 사진첨부합니다.
레벨1 밀크시슬 (대학생)
지난번에 cDNA PCR관련 질문을 드렸던 글쓴이입니다.
현재 Cloning을 진행하기 위해 cDNA상에서 PCR을 진행하고 있으며, 어려움이 있어 조언을 구하고자합니다.
(Leader를 기준으로 좌측부터 A B C D)
예상되는 size로는 B: 614 bp / C: 754 bp / D:679 bp입니다.
우선, B를 1band로 보고 Purification을 진행해도 될지 여쭤보고자 합니다.
또한 C, D를 gel elution을 통해 실험을 진행하고자하는데, multiband가 보여질 뿐만 아니라, 제가 원하는 size보다 크거나 더 선명한 Band들이 있는데 어떠한 부분을 이용해야할지 고민입니다.
PCR시 enzyme으로는 etaq를 사용하였으며, PCR조건으로는 95도 3분
95도 30초, 어닐링 온도 30초, 72도 1분 X35Cyxle과 72도 5분을 주었습니다.
이후 PCR조건을 변경하여 Pfu Ennzyme을 진행하였고,
95도 1분, 어닐링 온도 1분 , 72도 2분 X35Cyxle을 한 사진입니다.
이때 Pfu PCR을 통해 얻은 Product를 가지고 cloning을 진행하여도 괜찮을까요??
+)cDNA에서 PCR을 진행하기 위해 Primer를 여러번 제작해보고, 어닐링 온도를 비롯한 PCR조건을 바꾸어 실험해도 잘 되지않네요.....어려움이 많습니다 ㅜ 조언해주시면 감사하겠습니다. (gDNA에서 진행하기엔 size가 너무 크고 Intron사이의 길이가 너무 길뿐만아니라 명확한 Description이 없어 실험에 어려움이 있습니다..)
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