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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 cDNA PCR primer제작시 조언 부탁드립니다.
알밀크시슬(대학생)  |  11.10 00:34

식물에서 VIGSconstruct와 cloning을 하기 위해 cDNA를 이용하여 PCR을 진행하고 있습니다.

PCR시 Enzymer은 E-taq를 사용하고 있고, 평소 gDNA에서 PCR을 진행할때엔 크게 문제가 없으나 cDNA에서 PCR을 하게되면 multi band가 보여지거나, Band가 희미하게 보여지는 등(다른 size에 붙는다거나..) 문제가 많습니다...

 

PCR을 하기 이전 cDNA의 contem을 우려해 항상 농도 및 상태를 확인하고, (농도는 약280~340, 260/280: 1.84  260/230: 2.17) 실험을 진행합니다.

 

cDNA에서 문제가 없는 것을 보아, Primer를 제작하는데 문제가 있을 것으로 생각되는데,  내공이 많으신 많은 선배님들께서는 평소 primer제작 이나 cDNA를 활용한 PCR시 Tip이 있으신지 여쭤보고 싶습니다.

-----

+) primer를 제작할떄, 항상 GC 비율은 37~42%, size는 21~24 조건을 맞추고 primer의 sequence가 specific한 것을 확인 한 후에 PCR을 진행합니다.

cDNA 내부에서도 Primer를 제작하기도 하고 UTR부분과 CDS일부를 겹치는 방법으로도 제작을 하는데,

왜 cDNA에서는 PCR이 잘 되지 않는 걸까요...?ㅜㅜㅜㅜ

 

가장 실험의 기본이 되는 PCR이 되어지지 않아 속을 많이 앓고있습니다...ㅜ 선배님들의 조언을 간절히 부탁드립니다. ㅜ

#cDNA
 
#PCR
 
#primer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

target band가 나오는 상황이면 PCR 조건을 변경해서 최적화 해보세요.

대왕개구리SPEED  |  11.10 11:23  

1. 우선 cloning할 때에는 proof reading 기능이 있는 taq을 사용하셔야 합니다.

(E-taq 같은 거는 PCR band 확인용이나 sequecing 용으로 쓰시구요...)

그래야 cloning한 PCR product에서 mutation이 안 (덜) 생겨요.

2. multi band가 상황에 따라서는 해당 gene의 isoform을 잡았을 확률도 있습니다.

3. primer에 문제일 가능성도 있으므로, primer를 좀 더 specific region으로 바꿔보세요. 

4. 추출한 식물에서 해당 gene의 발현이 높게 나타나는 지, 그렇지 않다면 다른 식물에서 cDNA를 추출해서 실험을 해보시는 것도 좋겠네요.

화이팅

지나가다  |  11.13 13:52   
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