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질문 crispr-cas9으로 target gene을 자른 후 그 유전자의 발현 정도를 알아보고 싶어요
알ㄱㅁ(대학원생)  | 2019.11.07 15:34

crispr-cas9으로 target gene을 자른 후 그 유전자의 발현 정도를 알아보고 싶어요

 

cas9벡터로 target 유전자를 자른 후 아그로박테리움을 사용해 식물체에 접종한 후 식물체까지 봤는데요

이제 식물체의 잎을 채취에 RNA를 뽑아 cDNA를 합성 후 qPCR(Real time PCR)로 이 유전자의 발현 정도를 알고 싶습니다.

 

1) cas9벡터로 타깃유전자의 일부를 잘라냈다면 qPCR 결과를 봤을 때 밴드가 안떠야 하죠?

2) cas9벡터에 ligation 하기 위해 가이드RNA의 프라이머를 짜놓은것이 있는데, qPCR할 때 타깃유전자이 프라이머들을 그대로 사용해도 되는지? 아니면 qPCR을 하기 위해선 프라이머를 새로 짜야하는지 궁금합니다.

3) 만약 새로 짜야 한다면 어떻게 짜는건가요..?

4)qPCR을 이용하여 제가 자른 유전자의 RNA 발현 정도를 보고 싶은데, RNA 발현 정도를 보고싶을 때도 Total RNA 뽑은 후 cDNA를 합성한 후에 qPCR을 해야하는 건가요?

#qPCR
 
#primer
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뒷다리에우로파  |  2019.11.07   

이 질문은 저도 요즘 필요한 실험이라 찾아보고 있는데요

제가 참조한 논문은

Nature protocol에

Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system, F Ann Ran et al. 이 논문입니다.

 

제가 이 논문으로 이해한 바로는 CRISPR/Cas9을 통해서 genome부분이 바뀌는 양상이 두가지 경우가 있어요 논문의  2번째장 Fig2를 보시면

1. NHEJ repair기작에의해서 genome상의 deletion이 생기고 이로인해 종결코돈이 중간에 생겨버리는 경우

2. HDR repair 기작에 의해서 유전자 중간부분이 통째로 바뀌어버리는 경우

 

두경우중에 질문자님이 실험하신 방법이 무엇이고, 그 결과물이 둘중에 어떻게 나오냐에 따라서 바뀔꺼같아요

 

그리고 제 생각인데 genome에서 종결코돈이 생기도록 바뀐거면 mRNA까지는 영향을 안받을꺼같아서 qPCR로 확인이 안될것 같아요, 그래서 저는 western blot으로 확인을 하고 있긴 하거든요. 

논문에 보면 SURVEYOR assay를 통해서 확인한다고도 나와있으니 그 부분도 참조하시면 좋을듯 합니다.

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