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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Western 연이은 대실패 제발 한번만 도와주세요 ㅜㅜ 조언부탁드립니다
알SoS2(과기인)  |  11.07 11:20

안녕하세요 열심히 실험을 배우고 있는 신입 연구원 입니다.  본 실험을 맡게 되어 Western 실험을 진행 중에 있는데 3가지 항체를 보려고 하고 있습니다. 2주일 째 실험이 결과가 안나오고 망하고 있고 원인을 너무 못찾겠어서 결국 글을 올리게 되었습니다 ㅜㅜ 최대한 자세히 작성하고 사진도 첨부할 것인데 조언을 부탁드려요 .. 감사합니다

1. sample : brain : 30ug/10ul 로 로딩할 때 10ul 씩 로딩 합니다

2. 실험에 사용되는 Buffer 제작

- TBSt wash : dw950ml + 20x TBS 50ml + tween20 50ml

- Running : dw900ml + 10xSDS 100ml

- Transfer : dw700ml + 10xTrans 100ml + metanol 200ml

- Bloking : 5% Skim Milk

 

3. Gel 은 10%(60~80KDa, 43KDa), 15% (23~37KDa) 두개를 사용합니다.

 

4. Loading 은

Gel 두판으로 한번에 진행할 땐 40mA 110min 밴드 내려온거 확인하면서 내리고요, 한판 진행 시 30mA 100min 이내로 진행하였습니다   

5. Transfer는

100Volt 에서 70min 하였습니다. transfer가 끝나면 TBSt 로 5min씩 3회 반복한 뒤 blocking 진행합니다.

6. Blocking은

5% skim milk 를 그 날  만들어 1시간 RT 합니다.( 볼텍싱을 워낙 오래하고 만들자마자 바로 붓는게 아닌 삼십분 전 쯤 만들기 때문에 괜찮습니다. ) TBSt 로 5min씩 3회 wash 한 다음 1차 antibody 를 붙입니다.

7. 1차 항체를 각각 알맞게 붓고 4도에서 Overnight 으로 진행하고 다음 날 아침에 1차 항체들을 비우고 TBSt 로 5min 3회 wash 하고 2차 항체를 붙입니다.

8. 2차 항체는 mouse - anti (HRP) 사용합니다.   1 : 3000 으로 희석해서 사용하고 1시간 동안 RT로 붙입니다. 그 다음 TBSt 5min 3회 wash 한 뒤 Detection 합니다.

 

이상입니다..

제 실험의 문제들은 아래와 같습니다..  

1. Background 가 검은 얼룩이 져있다.

2. Band 자체가 안나온다.

3. non spectific band가 아주 많이 나온다.

4. 마지막 western 결과 중 23~37KDa 봐야하는 membrane을 보면

다들 25에 ------------- 이렇게 떠 있는 것이 아니고 -------_------ 하나만 다른 위치에 밴드가 나타난 것이 있는데 이것은 어떻게 설명해야 할지 모르겠습니다.

입니다.. ㅜㅜ 실험을 5번을 진행하면서 다 똑같은 조건으로 똑같은 실험자가 진행한 실험이 모두 동일하지가 않게 결과가 나오는데 교수님께 어떻게 설명을하고 트러블 슈팅을 해야할지 막막합니다 ㅜㅜ

일단 2차항체 제품 자체를 바꿔보았는데 한시간 뒤쯤 결과를 확인해서 어떻게 변할지는 아직 확인이 되지 않습니다

1차항체는 여태동안 실험한 약 5번 정도를 재활용 하였는데 맨 처음 했던것만 밴드들이 나오고 그 이후로는 안나오는것이 1차항체 문제가 클까요?  

글이 올라가지 않는줄 알고 확인버튼을 연타한것이 연타한만큼 도배가 되어서ㅜㅜㅜㅜㅜㅜ 죄송합니다 고의성 도배가 아닙니다...

 

이번에 2차항체를 바꾼 것을 확인해본 결과 정말 말끔히 밴드가 아무것도 뜨지 않았습니다 actin 만 나오더라구요 .. 항체를 6번째 재활용한것이 문제일까요?

 

#Westernblotting
 
#band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

제 기준 Tween 20의 농도가 꽤 높게 사용하시는거같아요.Tween 20 final 농도가 5% 인가요? 1f리터에 50ml 넣는다고 적으셔서..이게 맞다면...전 파이널 농도를 0.1%로 사용하고 있습니당.

올챙이클레엉  |  11.07 11:42  

어느 좋은 항체라도... 6번이나 쓰면 안나오지 않을까요...

2차 항체를 바꿔보는게 아니라 1차 항체를 새로 사용해 보세요 

 

항체바꿔보세요  |  11.07 11:43   

TBSt buffer 작성을 잘못하였습니다 ㅜ 500ul 넣습니다!

 

결과들을 첨부를 하였는데 게시하니 첨부파일이 사라졌네요 ㅜㅜ 1일차에는 잘 나오고 바로 다음실험부터 안나왔습니다 두번 째 부터도 이럴 수 있나요???

알SoS2  |  11.07 13:48  

unspecific 이 1일차에 많았으면 거기에 항체 다 붙어서 항체 다 날아갔을 수도 있죠..

올챙이클레엉  |  11.07 17:43  

안녕하세요 저도 선생님처럼 western blot으로 고생했던 경험이 있어 답변드립니다. (참고로 저는 1년째 고생중 ㅡ.ㅡ ...... ) 

 

1. 항체 재활용 : 이게 가장 문제가 큽니다. 5번 재활용하라고 교수님이 지시하던가요? protein이 그렇게 튼튼할리가요,

처음 해 본거에서는 밴드가 떴는데 이후에는 안 뜬다고 하시잖습니까? 보통 1st Ab 납품 받으면 1회분 사용량을 ice에서 aliqouts하여 -20'C에 보관합니다. 쓸 때마다 녹이고 얼리고하면 다섯번까지 갈 필요도 없이 두 세번쯤 녹였을 때 망가집니다. 

 actin은 워낙 항체가 튼튼해서 재활용해도 잘 뜨니 다른거에서 원인을 찾으시는거같은데 항체 재활용 하지 말아보세요.

 

2. Protein sample 자체의 문제. Brain sample을 homogenization할 때 열로 인해 protein에 damage가 안 가게 조심하세요.  얘들도 물론 sample 뽑을 때 aliqouts하여 deep freezer에 잘 보관하시구요.

-----_----- 이 문제는 항체가 망가지지 않았다면 protein sample 자체가 망가졌을 확률이 높습니다. 동일 condition에서 running이라면 sample 문제니까요. 

 

3. TBST 농도: Tween20의 final concentration은 lab마다 다르지만 보통 0.05~0.1%로 사용합니다. Tween20이 결국 protein detergent니까 농도 중요합니다. 확인해보세요.

 

4. non-specific band : 이건 1차항체 + protein sample 문제가 큽니다. 결국 위에 1~2번이 다 해결되어야 합니다. 그리고 Blocking을 할 때 vortex를 하나요? 저도 그렇고 제 주변도 그렇고 보통 transfer 돌려놓고 한숨 돌리고 신선한 skim milk 만드려고 충분히 stirring 합니다. 파우더 가루 없나 기울여보고 빛에 비춰보고 확인합니다ㅎ. vortex로 skim milk powder가 충분히 녹나 한 번도 안해봐서 저도 궁금하네요. 

 

5. Background : Washing 시간을 더 늘려보세요. 특히 1차항체 over night경우에는 충분히 씻어줘야 합니다. 

힘내용  |  11.07 17:54   
클레엉님 : 1일차에만 온 사이즈에 밴드들이 줄줄이 뜨고 그 다음 부터는 점점 밴드들이 줄고 결국 어제 결과를 본 6번째 부터는 아예 밴드가 나오지 않았습니다.. 선생님 말씀도 맞는 말씀이신듯합니다..


힘내용님 : 1차의 문제가 커보여 새로 항체를 만들어서 어제 저녁 overnight으로 붙였고 지금 워시 30min 하여 2차 붙인 뒤 오후 쯤 결과를 확인하려합니다 결과가 나오면 좋겠네요ㅠㅠ

- 샘플링이 문제이거나 샘플링할때 protein이 문제일까 싶어 그날 추출한 protein을 사용하였는데 어디서 damage가 생긴걸까요 칼같이 Ice 에서만 진행하였었습니다..

- 스킴밀크 볼텍싱은 충분히 한 줄 알았는데 다른 랩은 더 오래 가루까지 빛으로 확인하는 줄 몰랐습니다..ㅠㅠ 블로킹 버퍼 제작 과정은 브릭을 잘 찾아보아서 여러 곳의 방법을 파악하고 제 방법을 고쳐야 할 것 같네용..

이렇게 긴 조언 남겨주셔서 너무 감사드립니다 저에겐 정말 큰 도움 된 것 같습니다. 선생님께서도 좋은 실험 이루시고 좋은 하루 보내시길 바라겠습니다 감사합니다!!
알SoS2  |  11.08 10:38  

1. 조직에서 단백질 바로 뽑을 땐 세포랑 다르게 좀 조심하셔야 되고 조직마다 프로토콜이 따로 있는 경우도 있으니 구글링 한 번 해보세요.

2. 티슈의 경우 protein 양 정량 안하고 하시면 non-specific 많이 뜹니다.. 보통 lane당 10-50 ug 정도 내립니다.. 티슈 갈아서 다이렉트로 내린다면 actin이나 GADPH등으로 어설프게라도 단백질 양에 대한 가이드라인을 잡아줘야 됩니다..

3. 1차 항체 붙일 때도 skim이든 BSA든 넣어주고 돌려야 하고, sodium azide 등을 넣어줘야 합니다..

4. 2차 항체 그렇게 고농도로 쓰지 않습니다. 1, 2차 항체에 대한 titration없이 메뉴얼대로 또는 어깨너머로 기타.. 실험하시는 사람들이 많은데, 어떤 항체든 오게 되면 여러가지 농도 마련해놓고 positive control 을 이용해서 최적에 가까운 값을 잡아놓고 합니다.. 마찬가지로2차 항체도 NaN3만 제외하고 skim이든  BSA든 넣어주는게 백그라운드 잡아주는데 좋습니다.. 이건 항체 파는 회사들 대부분이 권장하는 내용이고..

5. 항체 재활용은 1차의 경우 안 나올떄까지 가능합니다.. 2-3달도 쓰는데요..

2차도 1주일 이내는 결과에 영향 안 줄 정도로 잘 나오는 편이고. 재활용에 문제가 있다면 NaN3 안 넣어서 곰팡이 자라서겠죠 (...)

6. 그리고 혹시나 해서 그러는데, mouse tissue 갈아서 녹인 다음에 내리고, anti-mouse xxx 항체 쓰는거면 당연히 더럽게 나오겠죠.. 일종의 mouse on mouse 를 하는건데..

7. 간혹 blocking 과정이 문제가 있을 수도 있으니 다른 blocking reagent를 찾는 것도 방법이 될 수 있습니다..  

올챙이더잘하고싶다  |  11.09 11:31  

6번 재활용이 조금 많은 숫자이긴 합니다만...

최초 희석 이후 1-2주 이내라면 보통 저는 문제가 없었습니다.

그리고, 2차항체는 아예 재활용을 하지 않습니다. (제 경우)

background 문제는 원인이 다양하긴 한데,

저는 washing은 보통 1X TBS-T로 15분 씩 3회를 하구요. 

Actin을 loading control 로 잡는 경우엔, 

저는 2nd antibody를 더 많이 희석합니다 (1:20K - 50K). 

물론 이것은 protein of interest의 종류와 발현양에 따라 달라질 수 있겠습니다만..

Band 자체가 안나오는것은, 얼마나 exposure 하셨는지는 모르겠지만..

actin이 너무 일찍 떠서, 다른 protein이 detected 되기 전에 ecl imaging을 종료하셨을 수도 있고, 혹은 그냥 antibody가 문제일 가능성도 있어서.. 

transfer membrane을 바꿔보시는 것도 background 조정에 약간은 역할을 하기도 합니다 (더 높은 pore size로 변경). 

하지만 20 kDa의 사이즈를 얘기하시는걸 보니, 0.2 를 쓰셔야 할것 같네요; 

 

작성해보고 나니, 별로 도움이 안되는 것 같습니다만; 

힘내세요!

Western 은 항상 messy 한 실험입니다... 하하

올챙이  |  11.11 09:09  

안녕하세요 열심히 실험을 배우고 있는 신입 연구원 입니다.  본 실험을 맡게 되어 Western 실험을 진행 중에 있는데 3가지 항체(<--어떤 항체인가요? 항체마다 살짝 조건이 다를 수 있습니다)를 보려고 하고 있습니다. 2주일 째 실험이 결과가 안나오고 망하고 있고 원인을 너무 못찾겠어서 결국 글을 올리게 되었습니다 ㅜㅜ 최대한 자세히 작성하고 사진도 첨부할 것인데 조언을 부탁드려요 .. 감사합니다

 

1. sample : brain : 30ug/10ul 로 로딩할 때 10ul 씩 로딩 합니다

2. 실험에 사용되는 Buffer 제작

- TBSt wash : dw950ml + 20x TBS 50ml + tween20 50ml (<-- tween 20 양 너무 많습니다. 500 ul 들어가야 할 듯)

- Running : dw900ml + 10xSDS 100ml (<-- SDS 만 들어가나요? glycine, Tris 안들어가나요?)

- Transfer : dw700ml + 10xTrans 100ml + metanol 200ml

- Bloking : 5% Skim Milk

 

3. Gel 은 10%(60~80KDa, 43KDa), 15% (23~37KDa) 두개를 사용합니다.

 

4. Loading 은

Gel 두판으로 한번에 진행할 땐 40mA 110min 밴드 내려온거 확인하면서 내리고요, 한판 진행 시 30mA 100min 이내로 진행하였습니다 

5. Transfer는

100Volt 에서 70min 하였습니다. transfer가 끝나면 TBSt 로 5min씩 3회 반복한 뒤 blocking 진행합니다.

(<-- blocking 전 단계에서 transfer가 잘 되었는지 Ponceau S 로 염색 한 번 해보시길 추천합니다.)

6. Blocking은

5% skim milk 를 그 날  만들어 1시간 RT 합니다.( 볼텍싱을 워낙 오래하고 만들자마자 바로 붓는게 아닌 삼십분 전 쯤 만들기 때문에 괜찮습니다. ) TBSt 로 5min씩 3회 wash 한 다음 1차 antibody 를 붙입니다.

7. 1차 항체를 각각 알맞게 붓고 4도에서 Overnight 으로 진행하고 다음 날 아침에 1차 항체들을 비우고 TBSt 로 5min 3회 wash 하고 2차 항체를 붙입니다.

8. 2차 항체는 mouse - anti (HRP) 사용합니다.   1 : 3000 으로 희석해서 사용하고 1시간 동안 RT로 붙입니다. 그 다음 TBSt 5min 3회 wash 한 뒤 Detection 합니다. (<-- washing 횟수 또는 시간 늘리세요)

 

이상입니다..

제 실험의 문제들은 아래와 같습니다..  

1. Background 가 검은 얼룩이 져있다. (<-- 경험상 2차 항체 농도 높거나 washing 제대로 안되면 이런 현상이 발생합니다.)

2. Band 자체가 안나온다. (<-- 1차 항체 첨가하거나 새로 녹이세요.) 

3. non spectific band가 아주 많이 나온다. (<-- 1차 항체를 BSA에 녹일 경우 non specific band가 더 잘 잡힙니다. milk에 녹여 사용하면 좀 덜 하구요.)

4. 마지막 western 결과 중 23~37KDa 봐야하는 membrane을 보면 

다들 25에 ------------- 이렇게 떠 있는 것이 아니고 -------_------ 하나만 다른 위치에 밴드가 나타난 것이 있는데 이것은 어떻게 설명해야 할지 모르겠습니다. (<-- 단백질이 modification 됐을 가능성은 없나요?)

입니다.. ㅜㅜ 실험을 5번을 진행하면서 다 똑같은 조건으로 똑같은 실험자가 진행한 실험이 모두 동일하지가 않게 결과가 나오는데 교수님께 어떻게 설명을하고 트러블 슈팅을 해야할지 막막합니다 ㅜㅜ

일단 2차항체 제품 자체를 바꿔보았는데 한시간 뒤쯤 결과를 확인해서 어떻게 변할지는 아직 확인이 되지 않습니다

1차항체는 여태동안 실험한 약 5번 정도를 재활용 하였는데 맨 처음 했던것만 밴드들이 나오고 그 이후로는 안나오는것이 1차항체 문제가 클까요? (<-- 아무래도 밴드가 전혀 나오지 않는다면 가장 큰 원인일 듯 합니다. 새로 녹여해 보시거나 아니면 1차 항체를 조금 추가하여 해보시는 것이 좋을 듯 합니다.) 

글이 올라가지 않는줄 알고 확인버튼을 연타한것이 연타한만큼 도배가 되어서ㅜㅜㅜㅜㅜㅜ 죄송합니다 고의성 도배가 아닙니다...

 

이번에 2차항체를 바꾼 것을 확인해본 결과 정말 말끔히 밴드가 아무것도 뜨지 않았습니다 actin 만 나오더라구요 .. 항체를 6번째 재활용한것이 문제일까요?

 

지나가다  |  11.11 10:27   

항체는 재사용하지 않는 것이 좋으나 만약 해야 한다면

1. Monoclonal Ab는 재사용이 가능(항원에 반응후에도 남은 항체의 결합력이 동일하기에)하나  잔존 milk 에 의한 부패 가능성 
때문에 보관(4도 보관 등)과 처리를 오염이 없이 잘해야 합니다 (sodium azide 첨가 등).

2. Polyclonal Ab는 재사용이 불가합니다. 항원 반응성이 높은 항체는 1차에 거의 소진되기 때문.

 

-> 항체가 아까우면 소량을 쓰고 항체 배양시간을 4도 밤샘으로 바꾸는 것을 추천합니다.  sodium azide 는 독극물입니다

baeckseung  |  11.11 17:04   
더 잘하고 싶다님 :

- brain을 -80도에서 보관해두었다가 막자사발로 갈아 앨리컷 해둔 조직 파우더를 가지고 sampling을 하였습니다 !

-protein 정량은 무조건 진행합니다 !

3. 1차 항체 붙일 때에 skim 을 섞는다고는 들었는데 재활용을 해야해서 그리 하지 못했습니다..ㅜsample로 항체를 받은것이라 정말 한번 희석하여 사용할것밖에 없어서요ㅠㅠ

2차 항체가 엄청 고농축 인줄은 지금 알았습니다ㅠㅠ 여기에다가는 skim을 섞어도 될것같습니다 해보겠습니다~!!

-1차 항체 재활용에 대해서는 정말 반가운 이야기이네요ㅠㅜㅜ전 벌써 항체가 망가졌을까봐 마음이 너무 착잡했거든요ㅠㅠㅜ

- 2차항체는 anti mouse 사용하는데 그게 mouse 끼리여서 지저분할수도있군요 정말 많은 지식 알아갑니다 ..

이렇게나 길고 세세한 내용 알려주셔서 너무 감사합니다 인터넷에서도 존경할만한 선생님들이 많으시다는걸 새삼 느낍니다!
알SoS2  |  11.11 21:36  
눈 님 :

항체를 재사용하고 2회차부터 밴드가 안나오기 시작하여서 항체문제가 아닌것 같으면서도 벌써 6-7회차를 넘어가고 있는 시점에서 보면 또 항체 재활용에 초점을 두고 문제를 찾아야 할지 어렵습니다ㅠㅠ

저는 15분씩 3번을 하면 (오래하면) 뭔가 떨어져 나가버리진 않을까하는 걱정에 오래 워시하지를 못하는데 괜찮은 거였군요!!

멤브레인 바꾸는것은 생각도 못해보았던 것이네요!! size 마커가 잘 넘어가도 protein이 안넘어갈수가 있어서 그런것일까요

정말 큰 도움 되었습니다 댓글 하나하나
다 소중하고 큰 의지가 되었습니다 감사합니다!!
알SoS2  |  11.11 21:36  
지나가다 님 :

넵! 제가 버퍼에 넣는 tween 20 양도 500ul 인데 제가 급하게 적느라 표기를 잘못하였습니다ㅠㅠ

- Running : dw900ml + 10xSDS 100ml (<-- SDS 만 들어가나요? glycine, Tris 안들어가나요?)

네 들어가지않습니다 ㅠㅠ 실험실에서 전달받은 protocol대로 만들어 사용하는것이라 .. 잘 모르겠습니다

- 2차 항체를 붙인 뒤의 wash 시간만 늘리면 될까요???

아래의 많은 조언 다 새겨듣고 실험할때 참고하여 보겠습니다ㅠㅜ긴 글 다 읽어주시고 코멘트 남겨주셔서 감사드려요!! 큰 도움 되었습니다 !
알SoS2  |  11.11 21:37  
baeckseung 님 :

헉 항체 data sheet를 다시 살펴서
poly ,mono 둘 중 무엇인지 보아야겠습니다ㅠㅜ 좋은 꿀팁 감사드립니다!! 항체에 대하여 더 공부를 해보아야겠습니다 도움주셔서 감사합니다 !
알SoS2  |  11.11 21:37  

제 경험상으론 background 문제는 2차항체 농도 또는 washing 문제일 가능성이 가장 큽니다.

band가 안나오는 거는 다른 문제일 가능성이 있구요

지나가다  |  11.12 15:05   
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