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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 primer design 해보는데 gene coding sequence와 binding하는 region의 의미를 정확히 모르겠습니다.
올챙이잉여맨(대학원생)  |  2019.11.05 12:13

Forward primer와 Reverse Primer를 디자인하는 중 protocol을 따라가고 있는데

gene coding sequence와 binidng 하는 region에서 melting temperature를 60도 정도에 맞추라고 되어있는데

 

dummy서열+ (제한효소 서열) +(primer로 만들려는 gene coding sequence와 동일한) 최소 18bp 동일하게 design

 

에서 gene coding sequence와 binding하는 region이라는 건 제한 효소 뒤에 붙인 gene coding sequence의 18bp를 말하는 것이 맞나요?

Tm계산하려는데 앞에 dummy서열과 제한효소를 포함하면 60도를 훨씬 넘어서 헷갈려 질문드립니다.

#primer
 
#primer design
 
#sequence
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개구리무광  |  2019.11.05   

cDNA나 plasmid로 부터 원하는 gene을 클로닝 하시는 건가요?

qPCR용이면 PCR 증폭률이 중요하기 때문에 최대한 F, R primer를 Tm 60부근으로 맞춰주는게 좋은데요.

클로닝이면 다소 효율이 떨어져도 원하는 gene이 PCR되기만하면 되기 때문에, 꼭 60도를 맞추려고 하지 않으셔도 됩니다. 애초에 증폭시키는 장소도 gene의 CDS 처음과 끝으로 정해져 있으니 딱 맞추기도 힘듭니다.

반면 colony PCR이나 qPCR 등은 증폭장소를 고를 수 있으니 수월하게 맞출수 있구요.

또한 F, R primer Tm이 다소 차이나도 되구요. Tm은 어디까지나 최적의 조건이니깐요.

HA Tag 같은걸 붙히지 않는다고 한다면

F 5` 더미(2~3bp) - 제한효소 - Kozak - Start codon ~ (18 bp ~) 3`
R 5` 더미(2~3bp) - 제한효소 - Stop codon ~ (18 bp ~ ) 3'

로 보통 구성하게 됩니다. F,R 의 Tm은 낮은 쪽에 gene region을 좀더 포함시키는 걸로 (18bp이상) 조절하려면 할 수 있습니다.
+ gradient thermal cycler있으시면 활용하면 좋습니다.

cDNA가 template인 경우 이대로 했는데 PCR 증폭이 안되면

F 5` 더미(2~3bp) - Start codon ~ (18~ bp) 3`
R 5` 더미(2~3bp) - Stop codon ~ (18~ bp) 3'

로 우선 cDNA으로 부터 gene을 증폭시켜 만든 PCR product를 만든 뒤
이걸 template으로 원하는 제한효소 등을 붙힌
위의 원래의 Primer set으로 진행해 보는 방법이 있습니다.

위의 방법도 안된다면, 

template에 문제가 있거나 (Template을 바꿈)
GC 비율이 너무 높은 gene (이 쪽에 특화된 Polymerase으로 바꿈)

아니면 한 번에 전부 증폭 시키지말고 내부의 제한효소위치를 확인한뒤 
몇 조각으로 나눠서 각각 PCR한 뒤 각각 제한효소 처리후
ligation으로 이어붙히면 됩니다.

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