실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
in vivo) Western blotting의 첫단계 sample prep., BCA 정량
레벨4 궁금궁그미 (일반인)
안녕하세요, western blot을 하는데 어려움이 있어 글을 남깁니다.
1. tissue에서 protein을 추출할때 다들 T-per buffer 와 RIPA buffer 중 어느 것을 사용하시나요?
2. buffer는 얼마나 넣나요? (조직과의 희석배율이 따로 정해져있나요?)
3.centrifuge 를 하였을때 더이상 pellet이 가라 앉지 않는 상층액만 나올때 까지 계속 centrifuge를 하여 분리해야 하나요? 아니면 그냥 처음 한번만 하나요?
(조직같은 경우는 셀과 달리 분리를 2번해도 계속 분리되더라구요)
4. protein 을 얻어서 정량을 할때, BCA assay (Thermo사) 를 사용하는데,
ⓐ standard albumin 이 키트에 들어있는게 2mg/ml 인데 최고농도를 5나 10 mg/ml 로 2 이상으로 잡아도 되나요? 그렇게 될 경우 일반 bovine serum albumin (BSA) powder 를 희석하여 만들어서 사용하여도 되나요?
ⓑ protein sample을 10 ul 또는 25ul 을 사용하라고 프로토콜이 나와있는데
스탠다드 프로테인과 샘플 프로테인을 동량만 넣으면 결과계산시에는 상관이 없는 건가요?
5. (첨부파일 그림 참조)
ⓐ 562nm 에서 흡광도 측정결과, 두가지 경우로 나오는데 standard curve를 그릴때는 BCA 그냥 값을 사용하나요? 아니면 blank BCA 계산되어 나오는 값(0점에서 시작)으로 사용해야 하나요?
ⓑ a에서 선택된 흡광도 값을 기준으로 하여 standard curve 를 그려서 첨부파일의 그림과 같이 /1000, 원하는 단백질 ug(20) / 나누기로 하여 다음과 같이 계산하여 나온 그 결과값을 사용하여 loading 하는 것이 맞나요?
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