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샘플수에 따라, 전기영동 시간, transfer, antibody reaction 등 각 단계에서 실험실마다 시간이 다릅니다만.
western blot 처음하시는거면 아래 프로토콜과 함께 설명해놓은 파일이 있습니다. 참고하시면 도움될겁니다.
1st day
시료 lysis, 전기영동, transfer, blocking,
2nd day
1st Ab, washing, 2nd Ab, washing, exposure
위와 같이 진행하고 있는데 연구자 마다 blocking, 1st Ab의 처리 시간이
조금씩 다른 경우가 많습니다.
비인산화 단백질을 볼 경우 protease inhibitor, 인산화 form을 보려면 phosphatase
inhibitor를 넣어 주는 것이 좋을 것 같습니다.
저는 1st Ab에서 O/N 처리하고
2nd Ab와 발색까지 다음날 처리합니다.
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레벨3
구루막
(대학생)
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19.10.18 18:29
모두 감사드립니다!
phospho form을 보려면 lysis~page 까지 시간을 단축 시켜야 할까요?
mouse을 여러마리 잡아야 해서 처음 조직을 적출한 애는
PBS에 두고 나중에 같이 lysis을 해야하는지 잘 모르겠습니다.
시간을 단축시킬 필요는 없습니다. 대신 phosphatase inhibitor 꼭 넣어주시고. Blocking solution은 skim milk 쓰지말고 BSA사용. PBST말고 TBST사용하세요
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레벨3
구루막
(대학생)
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19.10.19 01:47
감사합니다. bsa하고 tBST 사용하시는 이유가 있으실까요?
위에 제가 첨부한 파일 12번째장에 설명 적혀있습니다:)