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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 1430  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 보통 lysis하고 western 까지 얼마나 잡으시나요?
올챙이구루막(대학생)  |  10.18 12:46

이번에 tissue로 cytosol/nuclear extraction 후에 

western까지 해야하는데 처음이라서 다들 시간을 어떻게 잡으시는지

궁금합니다.

 

protease/phosphatase inhibitor을 넣어도 최대한 짧은게 좋겠죠?

 

#tissue
 
#lysis
 
#wetern
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
첨부파일 파일첨부: western blot.pdf (588 KB)

샘플수에 따라, 전기영동 시간, transfer, antibody reaction 등 각 단계에서 실험실마다 시간이 다릅니다만.

western blot 처음하시는거면 아래 프로토콜과 함께 설명해놓은 파일이 있습니다. 참고하시면 도움될겁니다.

앞다리아이스티  |  10.18 14:40  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1st day

시료 lysis, 전기영동, transfer, blocking,

2nd day

1st Ab, washing, 2nd Ab, washing, exposure

위와 같이 진행하고 있는데 연구자 마다 blocking, 1st Ab의 처리 시간이

조금씩 다른 경우가 많습니다.

비인산화 단백질을 볼 경우 protease inhibitor, 인산화 form을 보려면 phosphatase

inhibitor를 넣어 주는 것이 좋을 것 같습니다.

 

대왕개구리SPEED  |  10.18 14:41  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

저는 1st Ab에서 O/N 처리하고

2nd Ab와 발색까지 다음날 처리합니다.

금개구리안재진  |  10.18 16:06  

모두 감사드립니다!

 

 

phospho form을 보려면 lysis~page 까지 시간을 단축 시켜야 할까요?

mouse을 여러마리 잡아야 해서 처음 조직을 적출한 애는

PBS에 두고 나중에 같이 lysis을 해야하는지 잘 모르겠습니다. 

 

올챙이구루막  |  10.18 18:29  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
시간을 단축시킬 필요는 없습니다. 대신 phosphatase inhibitor 꼭 넣어주시고. Blocking solution은 skim milk 쓰지말고 BSA사용. PBST말고 TBST사용하세요
앞다리아이스티  |  10.18 22:11  

감사합니다. bsa하고 tBST 사용하시는 이유가 있으실까요?

올챙이구루막  |  10.19 01:47  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
위에 제가 첨부한 파일 12번째장에 설명 적혀있습니다:)
앞다리아이스티  |  10.20 18:18  
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