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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 웨스턴 시 로딩 계산 질문입니다.
뒷다리감사합니다!(대학생)  |  10.18 11:46

웨스턴에서 정량 후 2x 샘플버퍼를 이용해서 녹이려고 할 때 계산을 어떻게 하는지에 대해 질문 있습니다..

만약 제게 20 uL의 샘플이 있고, 해당 샘플 농도가 1 mg/ml 이라고 한다면,총 20 ug의 protein이 있는것이고, 2x 샘플 버퍼 20 uL을 넣어주면 총 볼륨이 40 uL가 되면서 농도는 0.5 mg/ml (0.5 ug/ul) 이 됩니다. 제가 로딩 시 30 ug의 protein을 건다고 가정하면, 60 uL 를....로딩해야 된다는 계산이 나오는데요..

 

1. 지금 제가 계산을 어디에서 잘못한건지 궁금합니다. 

2. 그리고 계산을 맞게 했을 때 lane 당 20 uL 정도 로딩하는 걸로 알고 있는데요. 로딩할 때는 샘플+샘플버퍼인 상태에서 로딩하나요? 아니면 어떠한 계산식에 의해 lysis buffer와 같은 무엇인가가 더 들어가나요?

3. 제가 아직 웨스턴 샘플 정량을 하지 않았는데요. 보통 몇 mg/ml 정도의 농도가 나오나요? 

4. 샘플 버퍼를 보통은 5X를 사용하나요?

 

간단한 부분인 듯 한데, 저 혼자서 생각하려니깐 어느 부분에서 잘못 된 건지 찾지를 못하겠습니다..도움 주시면 감사하겟습니다..

 

#western
 
#sample buffer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

1. 지금 제가 계산을 어디에서 잘못한건지 궁금합니다. 

: 잘못된 부분은 없습니다.

2. 그리고 계산을 맞게 했을 때 lane 당 20 uL 정도 로딩하는 걸로 알고 있는데요. 로딩할 때는 샘플+샘플버퍼인 상태에서 로딩하나요? 아니면 어떠한 계산식에 의해 lysis buffer와 같은 무엇인가가 더 들어가나요?

: lysate + sample buffer만 들어갑니다.

3. 제가 아직 웨스턴 샘플 정량을 하지 않았는데요. 보통 몇 mg/ml 정도의 농도가 나오나요? 

: 추출 시료 종류 및 초기 추출 시료 농도에 따라 다르게 나옵니다.

4. 샘플 버퍼를 보통은 5X를 사용하나요?

: 2X, 5X, 6X 모두 사용하며 lab마다 선호하는 종류가 다를 겁니다.

시료 농도가 높으면 2X를 사용해도 충분하고 시료 농도가 낮아서 1 well에

2X로 loading하기 힘들경우 5X나 6X를 사용하는 경우도 있습니다.

대왕개구리SPEED  |  10.18 12:31  

답변 감사합니다!

1. 그럼 최소한 어느정도의 단백질 농도가 확보되어 있어야 하는거네요?! 

2. 샘플마다 단백질 농도가 비슷하겠지만 그래도 조금씩 차이가 있을테고 때문에 원하는 단백질량을 로딩하고 싶을 때는 그 양이 다를텐데, 어떻게 다 일정하게 20 uL (예를 들어)에 맞춰서 로딩을 할 수 있는건가요? 예를 들어, 계산해 보니 18 uL를 사용하면 된다고 가정하면 나머지 2 uL를 lysis buffer를 채워주나요??

뒷다리감사합니다!  |  10.18 14:05  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 그럼 최소한 어느정도의 단백질 농도가 확보되어 있어야 하는거네요?! 

: 당연히 그렇습니다.

에를들어 cell에서 lysate를 만들 경우 충분한 단백질 양이 안나올 경우는

cell 양을 늘여서 lysis하면 됩니다.

예비 실험에서 cell 농도 별 단백질 양이 어느정도 나오는지 확인해보면

됩니다.

2. 샘플마다 단백질 농도가 비슷하겠지만 그래도 조금씩 차이가 있을테고 때문에 원하는 단백질량을 로딩하고 싶을 때는 그 양이 다를텐데, 어떻게 다 일정하게 20 uL (예를 들어)에 맞춰서 로딩을 할 수 있는건가요? 예를 들어, 계산해 보니 18 uL를 사용하면 된다고 가정하면 나머지 2 uL를 lysis buffer를 채워주나요??

: 동일 vol.을 loading하는 것이 아니라 동일 양의 단백질 양을 loading해야

합니다.

시료 별 단백질 정량을 해서 예로 20ug/well로 loading하고자 하면

시료 별 20ug을 취해서 sample buffer와 혼합해서 loading하면 됩니다.

따라서 시료 별 부피는 모두 다를 수가 있습니다.

대왕개구리SPEED  |  10.18 14:14  

답변 감사합니다!

뒷다리감사합니다!  |  10.18 14:26  
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