사진이 정확히 안보이지만 노폐물이 축적된 것으로 보입니다.
어떤 실험인지 정확히 모르겠지만 cell이 죽은 상태는 아니지만 배지를 바꾸지
않으면 상당히 빨리 죽을 겁니다.
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19.10.17 21:46
이번 실험은 keratinocyte 에 proinflammatory cytokine을 치고 타겟 단백질 및 mRNA 발현 관찰하고 있습니다.
cortisol에 영향받을 가능성 있어서 media supplement중 hydrocortisone뺀 media로 바꿔서 24시간 정도 deprivation 시킨 후 cytokine을 치고 있거든요
근데 하필 complete media만 충분하고 hc free media가 (supplement에서 따로 빼서 mix해줘야 합니다) 부족해서 6 well plate에 2ml->1.5ml/well 정도로 넣어줬어요..
24시간 후 media change를 해주면서 cytokine을 쳤어야 하는데 어차피 timecourse 24시간만 보려고 해서 change안해주고 cytokine만 쳤습니다.(24시간 deprevation, cytokine 친 후 24시간 까지) 즉 48시간 만 media에 있었는데.. 1.5ml이라 금방 노폐물이 축적된 걸까요? 후ㅠ 평소에는 48시간 조금 넘어도 (2ml) 변하지는 않았거든요.....이 사진은 harvest직전 찍은겁니다...ㅠ그나마 ㅠ
조금더 잘 나온 사진 첨부드립니다 ㅠㅠ speed님 답변 너무 감사드립니다.. 일단 contam 이야기 말고 노폐물 축적이라니 그나마 다행이군요ㅠ
그리고 UV 실험은 positive control 위해 실험중인데 48시간 지나니저렇게 변하네요.. 같은모양으로..
cell 종류 중에 granule을 생성하는 세포는 배양 중 세포내에 많은 알갱이가
생기는데 keratinocyte는 배양이 길어져도 세포내에 알갱이가 생기지는 경우도
있고 안생기는 경우도 있습니다.
그렇다고 오염이 된 것으로 보이는 점도 없습니다.
하지만 너무 많이 자라서 더 이상 성장을 할 자리가 없기 때문에 apotosis
pathway가 작동할 겁니다.
두번째 첨부 사진의 경우 세포 두께에 따라 낮은 초점의 cell, 높은 초점의 cell
모두 cell 내 granule이 보입니다.
48시간에 cell 내 노폐물로 인하여 granule이 보이는 경우도 있고 안보이는
경우도 있습니다.
오염은 아닌것 같은데 자주 보이는 morphology는 아닌것 같습니다.
항상 현재 다루고 있는 cell을 배양 할 때는 여러가지 형태의 morphology가
나오기 때문에 항상 세포의 배양 중 모양 변화는 눈여겨 봐서 익혀 두는게
좋습니다.
이런 것은 책으로도 안나오고 경험으로 판단하는 것이 가장 빠르고
정확합니다.
1. Human primary keratinocyte
https://www.phenion.com
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19.10.17 23:07
cell이 꽉 차서 그럴 가능성도 있겠군요..
답변 너무감사드려요ㅠㅠ 이걸 어떻게 갚아야 할지 ㅠ
몇가지만 조금더 여쭤봐도 될까요?
1. qPCR과 WB를 위해 sample harvest는 다 해놓은 상태인데..
이거 분석해 보고 또 재현실험 해보는 것이 낫겠지요?
2. keratinocyte 이 doubling time 이 48-60hr이라고 되어 있는데 생각보다 빨리 자라는것 같아요;; Time course 볼 때 미리 자랄 것까지 생각해서 조금 덜 찼을 때 cytokine 치는 것이 맞을까요? (50-60%정도만 찼을때?) cell 수가 적어서 분석이 잘 안될까봐 ㅠ
3. 또 어떤 논문 보면 media change안해주고 4일 후 분석한 논문(2016 sci.report)도 있거든요 그런 경우는 media를 좀 많이 넣어줘야 할까요?(2ml->3ml?/well in 6well plate) 재현해서 positive control만들려고 하거든요..ㅠㅠ UV 쬐고 4일 후에 분석하더라고요 media change 안했대요ㅠ
마지막으로 고견 부탁드립니다 ㅠ감사드려요 정말 ㅠ
실험 문제점이 잘 해결되고 결과가 잘 나오면 좋을 것 같습니다.
1. qPCR과 WB를 위해 sample harvest는 다 해놓은 상태인데..
이거 분석해 보고 또 재현실험 해보는 것이 낫겠지요?
: 네.. 재현성 실험을 동일 방법으로 해 보는 것을 권장 합니다.
2. keratinocyte 이 doubling time 이 48-60hr이라고 되어 있는데 생각보다 빨리 자라는것 같아요;; Time course 볼 때 미리 자랄 것까지 생각해서 조금 덜 찼을 때 cytokine 치는 것이 맞을까요? (50-60%정도만 찼을때?) cell 수가 적어서 분석이 잘 안될까봐 ㅠ
: time course에서 어떤 것을 볼지에 따라 조금 달라질것 같습니다.
time course 시간 중에 cell confluency가 80% 이상 되면 좋지 않을 것 같습니다.
따라서 cytokine 처리 기준 또한 조금 당기는 것도 고려해볼만 하다고 생각
됩니다.
또한 cell 수가 적어서 분석이 안되는 경우는 절대 없습니다.
분석법의 감도가 극미량까지 가능하기 때문에 결과가 잘 안나온다면
실험 진행상의 문제이지 감도 문제는 아닙니다.
cell에서 단백질을 분석하든 유전자를 분석하든 시료 중 단백질과 유전자는
눈에 안보입니다.
실험자의 손과 실험 skill을 믿고 실험하면 될 것 같습니다.
3. 또 어떤 논문 보면 media change안해주고 4일 후 분석한 논문(2016 sci.report)도 있거든요 그런 경우는 media를 좀 많이 넣어줘야 할까요?(2ml->3ml?/well in 6well plate) 재현해서 positive control만들려고 하거든요..ㅠㅠ UV 쬐고 4일 후에 분석하더라고요 media change 안했대요ㅠ
: 넓은 well을 사용해서 낮은 cell number로 실험을 시작하면 좋을 것 같습니다.
1. 배양 시간 별 mouse keratinocyte morphology입니다.
2. Human Keratinocyte에 growth supplement를 첨가하고 배양한 morphology입니다.
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쏭이쏭
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19.10.17 23:46
감사합니다 ㅠ정말감사드립니다.
복많이 받으실거에요!
밤늦은시간까지 ㅠㅠ 다시한번감사드립니다.
열심히 해보겠습니다!