1, 2번 시료는 분해된 DNA가 많이 보이지만 3, 4번 시료의 경우 RNA는 보이는데
분해된 DNA가 많이 안보입니다.
추출이 안된것인지 분해된 것인지 확실하지가 않는데 어떤 방법으로 DNA를
추출했습니까?
-
레벨2
독수리왕짱구
(과기인)
-
19.10.16 17:17
[소화제로부터 DNA 추출하기]
1. 10mL의 물로 입안을 세차게 약 1분간 가글하여 종이컵에 받는다.
2. 1.5ml E-tube에 가글액을 1.5mL 넣고 원심 분리(13,000rpm, 1분) 후 상등액을 버리고 또 가글액 1.5mL 넣고 원심 분리(약 3회 반복)하여 바닥의 pellet을 증가시킨다.
3. 25% 세제액 500㎕, 8% 소금물 500㎕, 10% 소화제 수용액 200uL를 E-tube에 차례로 넣고 pellet이 잘 분해되도록 피펫팅(up & down)하고 바로 55℃에서 10분간 인큐베이션 한다.
4. 70℃에서 5분간 인큐베이션 한다.
5. tube를 원심 분리기에 넣고 10,000rpm으로 10분간 원심 분리한 뒤 상등액 중 600uL를 새 E-tube로 옮긴다.
6. 냉동 보관된 100% ethanol을 상등액과 동량으로 천천히 넣고 상등액과 에탄올의 경계면 부분에 흰색의 DNA 석출물이 보이는지 확인하고 바로 invert mix 5~6회 한다.
7. E-tube를 원심 분리기에 넣고 13,000rpm으로 1분간 원심 분리한 뒤 상등액을 버리고 비워진 E-tube에 5번의 나머지 상등액을 넣고 지금까지의 작업을 한 번 더 반복한다.
8. 70% ethanol 700uL 넣고 다시 13,000rpm으로 1분간 원심 분리한 뒤 상등액을 버린다.
9. 한 번 더 잠시 원심 분리하여 tube 벽에 묻어있던 잔여액을 모두 바닥으로 모아서 200㎕ 마이크로피펫 팁을 이용하여 제거한다.
10. 증류수 60㎕를 떨어뜨리고 피펫 팁을 이용하여 튜브의 하단 벽면에 희미하게 코팅된 DNA tapping으로 녹인 후 냉동 보관한다.
7. 70% 에탄올로 씻어내는 과정의 의미는 무엇인가?
8. DNA가 제대로 추출됐는지는 어떻게 알 수 있을까?
< DNA 추출 시약 만들기 >
준비물
주방 세제와 NaCl(또는 소금) 및 소화제 3알, 막자사발, 50mL 코니컬튜브, 100% 에탄올, 70% 에탄올, 전자저울, 메스실린더, 약수저, 약포지, 마이크로쎈트리퓨지, 마이크로피펫(또는 주사기 마이크로피펫)
• 25% 세제 희석액 : 세제액 25mL + 증류수 75mL
• 8% NaCl 수용액 : NaCl 8g + 증류수 100mL
• 70% 에탄올 : 100% 에탄올 70mL + 증류수 30mL
• 10% 소화제 희석액 : 소화제 5g + 증류수 50mL
Tip 소화제 표면의 당질 외피를 제거하려면...
비커에 소화제 3알과 함께 따뜻한 물을 붓고 표면의 당질이 녹을 수 있도록 잠시 불린 다음 가볍게 흔들어 주면 당질 외피가 떨어져 나가는 것을 볼 수 있으며 모두 제거되면 소화제를 깨끗한 물로 씻어 내고 막자사발을 이용하여 분쇄한다.
6번 과정에서 DNA 용액 대비 최소 2배의 에탄올을 넣어야 합니다.
7번 과정에서 최소 5분 이상 원심분리하는 것이 좋습니다.
9번 과정에서 DNA가 제거될 수가 있으니 9번 하지말고 바로 10번을 진행하는
것이 좋을 것 같습니다.
70% 에탄올을 처리하는 것은 남아있는 소금을 제거하는 역할이고 첨부한
방법으로 충분히 DNA를 분리할수 있을 것 같습니다.
-
레벨2
독수리왕짱구
(과기인)
-
19.10.17 09:20
기타 사진 입니다.
-
레벨2
독수리왕짱구
(과기인)
-
19.10.17 09:23
DNase의 작용은 문제가 없나요?
70도를 95도로 온도를 높여도 동일한 결과를 얻었어요
답변자 님께서 안내해 준 대로 다시 시도해 보고 결과를 보여 드릴께요
이 방법을 통해 얻은 것을 pcr 용 DNA로 사용해도 가능할 지 궁금합니다.
-
레벨2
독수리왕짱구
(과기인)
-
19.10.17 09:27
[모근세포 DNA 추출]
1) 네임펜으로 1.5-mL tube(또는 PCR tube)에 이름을 쓴다.
2) 모근 부착 상태가 좋은 5~13가닥 내외의 모근을 1cm 크기로 절단한여 모은다.
3) 튜브에 멸균증류수 30㎕와 10% Chelex®(BIO,USA)를 50㎕(또는 5% 100㎕)과 1㎍/㎖ proteinase K(SIGMA, USA) 1㎕를 첨가한다.
4) 55℃의 water bath에서 overnight 시킨다.
5) 튜브 캡을 닫은 후 동동이에 끼워서 boiling water bath(또는 히팅블록)로 100℃ 15분간 끓인다.
6) 완전히 식힌 후 3000rpm에서 5분간 원심분리 시켜 상등액 2㎕를 pcr 반응에 이용한다.
(이 방법에서 조언이 있으면 부탁드려요)
두번째 첨부한 기타사진에는 DNA가 전혀 추출이 안되었습니다.
온도는 60도 이상 올리지 않는 것이 좋습니다.
모근세포 추출방법은 PCR용 template라면 6번 원심분리 단계에서
13,000rpm, 10분 원심분리한 후 상등액 0.1, 0.5, 1ul를 PCR 해보세요.
PCR이 잘 안되면 EtOH로 침전 시킨 후 증류수로 녹여 PCR에 사용해보세요.
-
레벨2
독수리왕짱구
(과기인)
-
19.10.17 16:41
chelex resin 100을 이용한 추출결과 입니다.
이사진도 gDNA가 거의 다 분해되었고 분리가 잘 안되었습니다.
-
레벨2
독수리왕짱구
(과기인)
-
19.10.21 09:33
well에 형광을 보인 것은 무엇일까요?