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질문 HepG2 cell에서 ROS 실험을 진행중입니다
알얌지(대학원생)  |  2019.10.15 15:35

안녕하세요 현재 저는 HepG2에 천연추출물을 처리하여 ROS의 생성변화를 알아보는 실험을 진행중입니다. 

항상 ROS만 진행하면 표준편차가 너무 크게 나타납니다...

cell seeding에 문제가 있는것 같진 않은게 동일한 방법으로 MTT도 진행해봤지만 ROS를 진행했을 때 만큼 표준편차가 크게 나타난적이 없습니다... 

black 96well plate를 사용하고 있으며 배지는 serum과 phenol red가 없는것을 사용하고 있습니다. 또 형광리더기를 사용하여 485-520nm로 측정하고 있습니다. 

H2O2 100uM가 되게 처리하여 활성산소를 증가시키고 DCFDA 10uM로 형광을 유도합니다.

형광을 처리하지 않은 군에서는 확실하게 낮게 나타나고 당연히 표준편차값도 굉장히 적게 나타납니다. 하지만 나머지군들은 비슷한 값을 나타내기가 너무 힘듦니다... 

seeding의 문제라 생각하고 정말 여러번 했지만 해결이 잘 안됩니다ㅜㅜ

원인을 해결하고 싶어서 조언을 구합니다ㅜㅜ   

#ROS
 
#HepG2
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
뒷다리hcp074  |  2019.10.16   

DCFDA 실험은 매우 주의해야 합니다.

DCFDA를 cell에 처리하고, 빛을 쪼여주면 시간이 갈 수록 형광이 증가합니다. (물론 어느 순간에는 형광이 감소하긴 하겠지만요.)

DCFDA 처리 시간을 초 단위까지 정확히 같게 하여 측정하시길 바랍니다.

저희는 96well을 사용하지 않고, sample 하나 하나씩 각각 DCFDA를 정확히 같은 시간 처리 후, FACS로 분석하였습니다.

예전에는 형광현미경을 사용해 본 적도 있는데, FACS를 이용했을 때 더 정밀하게 ROS를 볼 수 있었습니다.

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