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TE buffer는 Mg와 같은 중합효소에 필요한 이온을 제거하기 때문에 증류수가
가장 좋을 듯 합니다.
농도를 맞추기 위해 DW로 희석하는 것이지 DW로 희석해서 농도가 맞지 않는
것은 희석을 잘못한거 같습니다.
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레벨1
amylovora
(과기인)
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19.10.15 12:15
오 감사합니다 다행이네요
그러면 블랭크 잡을때도 DW로 잡으면 되나요?
DW로 희석하셨으면 블랭크는 DW로
TE버퍼 쓰셨으면 블랭크가 TE버퍼가 되어야합니다.
블랭크는 어떤 시료를 녹인 용액이어야 합니다.
DNA 원액을 정량하고 사용하는 방법을 원론적으로 정리하면 다음과 같다.
NanoDrop으로 신뢰할 만한 측정값을 주는 DNA 농도 범위를 파악한다.
DNA를 정제 한 후 개략적인 평균 농도를 파악한다.
DNA를 정제한 후 DNA를 녹이는 용매의 양은 원액 혹은 농도 조정 후에도NanoDrop 신뢰 측정값 범위를 만족하도록 한다. 초기 용매의 양은 가능하면 농도 조정 시 희석 하기에 충분하도록 높은 농도로 한다. DNA pellet을 녹이는 경우라면 0.1x TE를 용매로 사용하는 것도 좋다. 만약에 DNase에 오염되는 경우 EDTA가 포함된 용매는 분해를 방지할 수 있기 때문이다. 다만 EDTA는 DNA polymerase 활성을 저해하므로, 희석에 의해 다음 반응에 영향을 주지 않는 정도의 농도로만 사용한다.
NanoDrop으로 DNA 농도를 측정한다.
각각 다른 농도의 DNA sample을 같은 농도가 되도록 희석한다. 이때 사용하는 용매는 원액이 녹아 있는 것과 동일한 것을 사용한다. DNA를 정제할 때 각 샘플별로 차이가 많을 경우 정량 전에 예비 자료가 있다면 가급적 비슷한 농도가 되도록 용매의 양을 조절하는 것도 필요하다. 왜냐하면, DNA 농도 차이가 작은 경우는 희석 후 계산치와 유사하게 되지만, 농도 차이가 클 경우 단순히 수학적인 계산에 따라 희석하고 다시 측정해 보면 농도가 정확히 맞지 않는 경우가 많기 때문이다.
PCR에 사용하는 template를 DNA 원액으로부터 희석할 경우 다음 반응 (PCR 혹은 ligation)을 고려하여 EDTA가 포함되지 않은 DW를 사용한다.
PCR에 사용하는 template 양은 반응액에 들어 가는 enzyme, buffer 사용량을 고려하되 가급적 DNA template의 사용 volume을 크게 하는 것이 좋다. 왜냐하면, DNA template 사용 오차가 PCR에 가장 큰 영향을 주는데, volume이 적을 수록 pipette의 기계적 오차도 크기 때문이다.