실험 Q&A Immunology > Immunoprecipitation
Immunoprecipitation western blot 결과에 대해서 궁금합니다
레벨1 j12 (대학원생)
안녕하세요.
FLAG-tagged protein을 immunoprecipitation 하는데 western blot결과에 대해서 질문드립니다.
FLAG tag antibody를 amine-reactive resin에 바인딩해서, FLAG-tagged protein을 잡아내려고 하는데, 최종 elution을 FLAG tag antibody를 primary로 써서 western blot해보면 band가 안 보입니다ㅠ
지금 사용하는 키트는 항체를 resin에 immobilized시킨거라 재사용할 수 있다고 하는데, 여러번 해봤는데도 elution에 FLAG-tagged protein이 안 나오는 것 같습니다.
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1. tissue lysate
2. flow-through after pre-clearing
3. flow-through after binding
4. 1st wash
5. 1st elution
6. 2X Laemmli sds sample buffer 넣고 boiling 한 eluate
lysate와 pre-clearing 이후까지 있던 band가 antibody가 immobilized 된 resin에서 incubating 하고 난 후의 flow-through에서는 보이질 않습니다. 그래서 antibody-antigen binding은 이뤄진 것 같은데 elution이 안 됩니다...
지금 사용하는 elution buffer는 low pH buffer여서 high pH buffer, ionic strength buffer이용해봤는데, elution이 안 이루어지는 것 같습니다.
그래서 최종적으로 결합하고 있는 resin 자체에 sds sample buffer 넣고 boiling해서 elution한 sample도 western blot해보았는데 band가 안 나옵니다...
이 protein은 어디로 간 걸까요?ㅠㅠㅠ
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