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 전체 > Immunology > Immunoprecipitation
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질문 Immunoprecipitation western blot 결과에 대해서 궁금합니다
알j12(대학원생)  | 2019.10.10 07:11

안녕하세요.
FLAG-tagged protein을 immunoprecipitation 하는데 western blot결과에 대해서 질문드립니다.
FLAG tag antibody를 amine-reactive resin에 바인딩해서, FLAG-tagged protein을 잡아내려고 하는데, 최종 elution을 FLAG tag antibody를 primary로 써서 western blot해보면 band가 안 보입니다ㅠ
지금 사용하는 키트는 항체를 resin에 immobilized시킨거라 재사용할 수 있다고 하는데, 여러번 해봤는데도 elution에 FLAG-tagged protein이 안 나오는 것 같습니다.

upload_image

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1. tissue lysate
2. flow-through after pre-clearing
3. flow-through after binding 
4. 1st wash
5. 1st elution
6. 2X Laemmli sds sample buffer 넣고 boiling 한 eluate

lysate와 pre-clearing 이후까지 있던 band가 antibody가 immobilized 된 resin에서 incubating 하고 난 후의 flow-through에서는 보이질 않습니다. 그래서 antibody-antigen binding은 이뤄진 것 같은데 elution이 안 됩니다...
지금 사용하는 elution buffer는 low pH buffer여서 high pH buffer, ionic strength buffer이용해봤는데, elution이 안 이루어지는 것 같습니다.
그래서 최종적으로 결합하고 있는 resin 자체에 sds sample buffer 넣고 boiling해서 elution한 sample도 western blot해보았는데 band가 안 나옵니다...
이 protein은 어디로 간 걸까요?ㅠㅠㅠ

#immunoprecipitation
 
#western blot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리TX  |  2019.10.10   

제 생각엔 wash을 너무 많이 (또는 오래) 하신것 같습니다. 다시 말해 다 떨어져 나갔을수도..

4번의 wash는 이미 dilution된 상태라 단백질이 있더라도 웨스턴에서 안잡혔을수도 있구요...

일단 wash 횟수 (wash buffer 부피 역시) 줄여 보세요.

그리고 실험에서 positive control (FLAG fused protein) 없네요..

이건 처음 실험하실땐 아주 중요합니다..꼭 확인해보세요.

알j12  |  2019.10.11   

답변 감사드립니다!
wash는 200ul로 3번 진행했고,
첫번째 washing의 flow-through를 western한게 4번 lane인데,
target 단백질이 빠져나왔어도 dilution 되어서 웨스턴에서 band가 안 보일 수 있다는 말씀이신가요?

flag-tagged target protein을 overexpression한 tissue의 lysate(첫번째 lane)를 positive로 잡았는데 잘못 된 걸까요?
맨 위쪽 band를 target protein으로 보고 있습니다.

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