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 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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질문 dh5alpha 컴셀 배양
알Morring(대학생)  | 2019.10.09 02:09
dh5a 셀을 샀습니다.
1. transform을 위해 "클린벤치 밖에서" 땄는데(튜브 오픈)LBA(plate)에 다시 배양하면 dh5a만 나올까요?
2. 그리고 계속 계대&스톡해서 써도 되나요?
3. 1에서 tf하기 위한 pcr product를 만들 때, 템플레이트도 dh5a 셀을 사용하나요?
4. tf과정 프로토콜을 대강 쓰자면
1)pcr producr+methylation 시약(dpn1?)+dh5alpha
2)히트쇼크
3)LB 배양
4)LBA에서 셀렉션
인데 3)까지 클린벤치 밖에서 수행해도 되나요?
#계대
 
#컴셀
 
#dh5a
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2019.10.09   

dh5a 셀은 E. coli DH5a를 말하는 거죠?

이 세균을 LBA plate( 아마도 LB plate에 ampicilin이 포함됬다는 의미인 듯)에 배양하면 안자랍니다. 암피실린 저항성이 없기 때문입니다.

클린벤치 밖에서 실험하기 위해서는 알콜램프로 멸균조작을 한다면 오염 가능성을 줄일 수 있지만 그냥 하면 아마도 오염으로 고생하실 듯 합니다.

TF 과정을 쓰셨는데 이게 무슨 내용인지 모르겠군요.

PCR product를 그냥 대장균에(clinical isolate도 아니고) 넣으면 안될것 같죠?

알Morring  |  2019.10.09   
DH5a에서 뺀 plasmid를 템플레이트로 해서 pcr을 진행하고, 그걸 바로 DH5a(컴셀)에 넣고 히트쇼크 한다고 들었어요! 히트쇼크로 plasmid를 이콜라이에 넣고 원활한 배양을 위해 LB에서 배양 후 LBA로 옮기는 걸로 알고 있는데 학부 친구가 DH5a를 클린벤치 밖에서 뜯어버렸고, 주문한 게 오려면 빨라도 다음주라고 들어서...
그냥 다른 방에서라도 DH5a받아와서 해야겠네요ㅠㅠ...
대왕개구리강시  |  2019.10.09   

PCR product를 그냥 대장균에 넣으면 안되는것은 알죠?

복제원점이 없어서 복제가 되지 않으며, 항생제 저항성 마커가 없어서 TF가 됬는지 확인이 안됩니다.

개구리당구왕빠킹  |  2019.10.09   

competent cell을 배양하고 계대하면 일반 E. coli 가 됩니다

알Morring  |  2019.10.09   
강시님// 저희 실험실 프로토콜에는 PCR Product를 바로 이콜라이에 넣는 걸로 되어있습니다...TF후 LBA(암피실린 항생제 배지)에 기르면 자랐구요...
당구왕빠킹님//네네 컴셀이 필요한 게 아니라 컴셀을 만들 건강한 이콜라이가 필요해서요. 자라긴 하는 군요!
개구리당구왕빠킹  |  2019.10.09   

PCR product를 바로 transformation 한다라... protocol 점검해보시기 바랍니다.

알Morring  |  2019.10.09   
pcr product에 dpn1넣고 반응시킨 뒤 컴셀에 넣어주는 거 아닌가요?!
pcr product에 다른 처리가 더 필요한가요?
개구리당구왕빠킹  |  2019.10.10   

PCR의 template로 사용한 것이 plasmid이고, 이 plasmid를 고대로 증폭시켜서 여러 copy를 만들 수 있는 특별한 기술을 가지고 있으면 상관 없지만 아니라면 recombinant DNA 제작 단계가 완전히 생략되어 있네요. Recombinant DNA를 만들기 위한 vector system과 transformation 이후 selection 과정에 대해 더 공부해보심이 좋을듯 합니다.

꽃개구리TX  |  2019.10.10   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 질문의 이유가 혹시나 공기중에 어떤 박테리아가 들어가서 자라지는 않을까? 해서 인가요?   답변은 4번을 참조하세요.

 

2. 처음 bacterial stock (25% glycerol / 1X LB) 만들어 -80도에 보관하시고, 다시 사용시 bacteria가 얼려진 상태(녹이면 안됨)에서 신속하게 소량을 취해(pipet tip으로 얼린 stock을 찍으세요) 배양하신다면, bacteral stock는 최소 5년 이상 쓰셔도 될꺼에요. 

 

3. Template는 plasmid 일테고, plasmid를 얻는 방법은 DH5a를 쓰시면 됩니다.

 

4. DpnI을 쓰신다는걸로 봐서 QickChange 방법을 써서 plasmid 전체를 PCR 하신것 같은데요...(맞나요?)   하여튼 박테리아 관련 실험은 그냥 실험 테이블에서 버너 켜 두시고 그 앞에서 실험 하시면 아무 문제 없어요. 곰팡이 연구하는 실험실 아닌 이상 공기중에 뭔가가 들어가서 오염되거나 하지 않습니다.

개구리당구왕빠킹  |  2019.10.11   

Quickchange method는 처음 보네요... 좋은 방법 알아갑니다.

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