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질문 단백질 발현 시 벡터를 형질전환을 2번 하는 이유..
알E.jay(일반인)  |  2019.10.07 22:12

안녕하세요.. 혼자 공부하다가 어떤 논문을 읽었는데 pGEM-T 벡터에 유전자를 삽입하고 이걸 E.coli DH5α 에 넣고 콜로니 확인해서 다시 pET-28a에 삽입하여 최종적으로 E.coli BL21에 형질전환시켜 단백질을 발현시키는데...

제가 알기론 PCR 돌려서 벡터에 삽입하고 E.coli에 형질전환 시키는 걸로만 알고 있었는데 왜 번거롭게 2번의 형질전환을 하는건가요?...

 

 

#coloning
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.10.07   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

이 경우는 3번의 TF를 해야 합니다.

1번째는 insert를 T vector에 넣어 확보하는 과정, DH5a에 TF

2번째는 발현 vector에 insert를 넣는 과정, DH5a에 TF

3번째는 제작된 발현 vector를 발현 균주에 넣는 과정, BL21(DE3)에 TF

꽃개구리TX  |  2019.10.08   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

번거롭게 2번 하는 이유는

1번에 하면 실험이 잘 안되기 때문이죠..

(1번에 한다는건 insert PCR이랑 pET28a랑 같은 제한효소로 각각 자르고 다시 ligation하는것)

하지만 경험 많은 분들은 그냥 1번에 다 합니다...

 

알E.jay  |  2019.10.08   

두 분다 바쁜시간에 답변감사합니다. 어찌보면 바보같은 질문이었을텐데 ㅎㅎ

정확한 이유는 모르겠더라도 한 번에 하면 실험이 잘 안된다고 알고있겠습니다.

ㅇㅅㅇ  |  2019.10.09    

T 벡터에 유전자를 삽입하는 이유는

PCR을 통해서 원하는 DNA부분을 증폭시킨 뒤에 나오게 되는 PCR 산물은 

5' 끝에 phosphate가 없고 3'에 A가 하나 더 붙어있습니다. 

때문에 이와 상보적으로 결합할 수 있는 T-vector을 사용한 후에 

Ecoli안에서 많은 양의 plasmid 복제가 일어나도록 키웁니다. 

즉 T-vector에 트포를 해서 키우는 첫번째 과정에서 T-vactor는 운반체 역할이라고 생각하시면 될거같습니다. 

그 후에 다시 plasmid를 얻은 뒤에 발현벡터에 ligation하여 원하는 균주에 트포를 시키므로 두번의 형질전환을 거치게 됩니다. 

발현벡터에 ligation을 할 때에는 PCR을 거치지않고 제한효소 처리를 하므로 원하는 발현벡터에 ligation이 가능합니다. 

 

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