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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 웨스턴블랏문의드립니다.
뒷다리졸업은언제하나(대학원생)  |  10.07 18:41
첨부파일 파일첨부: WB.jpg (93 KB)
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안녕하세요:)

 

대장균에서부터 발현한 단백질(C-His tag)을 웨스턴블랏으로 확인하고, Ni-NTA정제 중에있습니다.

그런데 western blot (WB)결과와 Ni-NTA정제한 결과사이에서 혼동이와서 문의드립니다.

 

1. 일단 WB결과는 His tag binding band를 확인하지 못 하였습니다.

대장균으로 부터 발현한 mixture를 SDS-PAGE에 걸어서 웨스턴블랏을 진행했습니다.

웨스턴 블랏은 다음와 같은 시약을 사용하였습니다.

Primary Ab: Mouse Anti-His Ab

Secondary: Goat Anti-mouse Ab-HRP

Substrate: ECL → chemiluminecence로 detection, TMB → 육안으로 확인

 

1번 레인에는 E.coli 파쇄액 중 soluble fraction이고,

2번 레인에는 control로 His tag이 달린 단백질을 내렸습니다.

(발현하고자하는 펩타이드 크기가 10 kD정도입니다.)

NC membrane에 transfer해서 ponceaus S로 염색해서 확인 후 (이미지 왼쪽 첫번째) WB를 진행하였습니다.

WB 결과 ECL과 TMB 모두 control에서만 band가 뜨는 것을 확인하였습니다.

 

2. Ni-NTA결과 (이미지 가장 오른쪽)

Ni-NTA정제한 eluate를 SDS-PAGE에 내려보았는데요..

(아직 dialysis, 농축 진행중이라 WB 데이터는 없음, 현재는 정제한 sample을 농축하여 WB을 준비중)

Ni-NTA 레진으로 정제하여 300 mM과 500 mM imidazole/PBS로 elution하였을시 타겟크기와 유사한 크기의 band를 확인하였습니다.

(이미지는 그 중 500 mM imidazole/PBS로 elution한 것)

 

 

WB 사진으로는 control band만 뜨고 제 샘플의 band가 없는데..

ECL substrate: control band가 너무 진하여 sample의 band를 detection하지 못 한것인지?

TMB substrate: sample내 타겟 펩타이드를 잡을만큼 sensitivity가 좋지 않아서 확인하지 못 한것인지?

아니면 His-tag 펩타이드가 발현이 안된 것인지...?

 

왜 WB로는 아무 band가 detection되지 않는데, Ni-NTA레진으로 정제하였을 경우는 정제된 것으로 보이는 band가 보이는 것인지..ㅠㅠ

WB시 His tag이 다른 것들에 의해 가려져서 detection이 안되는 것인지...

문의드립니다 ㅠㅠ

 

일단 정제한 eluate를 농축하여 다시 WB를 진행하보는 것이 좋을까요?

 

 

 

감사합니다.

 

 

 

#western blot
 
#His tag
 
#Ni-NTA
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분자량이 작아서 구조적으로 his tag이 가려질 확률은 낮을 것으로 보입니다.

발현 결과 시간별로 sampling 했을 때 확실히 증가하며 cotrol과 비교했을 때

target protein이 확실한 것은 확인했습니까?

대왕개구리SPEED  |  10.07 18:56  

이 실험도 콘트롤이 없군요.

IPTG induction으로 발현을 시켰으면, induction 전 후를 비교하기 위해서 젤에, 

마커, induction 안한것, induction 시킨것을 같이 걸어서 inductin을 확인해야 합니다.

induction 후에 soluble fraction과 inclusion body를 확인해서 원하는 재조합 단백질이 soluble하다는 것을 확인하세요.

그 다음에 컬럼을 걸어서 정제된 단백질이 나온 것을 다시 젤에 걸어서 확인해야 합니다.

확인 후,

젤에

1. 마커

2.  induction 안한것,

3. induction 시킨것

4. soluble fraction

5. inclusion body

6. 컬럼정제한 재조합 단백질

 

이렇게 걸어서 WB을 하시지요.

그래야 정말로 induction이 되었는지, induction 된 단백질이 soluble한지, 컬럼으로 정제가 되었는지를 확인할 수 있습니다.

WB을 했지만 결과가 안나오는 이유를 찾기 위해서는 SDS-PAGE 사진이 내손에 쥐어져 있어야 하는 겁니다.

모든 실험을 단계를 생략하지 마시고 차례차례 진행해보세요.

대왕개구리강시  |  10.07 21:24  
첨부파일 파일첨부: SDS.png (164 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요 SPEED님, 강시님^^

 

강시님이 말씀하신 부분에서 제가 놓친 부분이 있다는 것을 깨닳았습니다.

 

일단 induction 테스트는, un-induction것은 따로 SDS를 진행하지 않았습니다.

대신 target peptide gene이 없는 vector를 control로하여 IPTG induction후 3시간, 5시간 incubation 하였을 때 sup.과 pellet으로 나누어 (모두 PBS에 suspension 하여) SDS-PAGE를 진행하였습니다.

 

실험과정에서 pellet에서 6 kD과 14 kD사이에 밴드가 incubation 시간이 늘어남에따라 더 두꺼워지는 것과 control vector와 비교하였을 경우에도 더 두껍게 발현된 것 처럼 보이는 밴드를 확인하였습니다.

 

지도 교수님께 타켓 펩타이드가 pellet으로 나오는 것 같으니, inclusion body 정제 방법을 이용하여 정제 후 refolding하는 방식으로 실험을 진행하겠다고 말씀드렸으나

지도교수님께서는 타겟 펩타이드의 서열 사이에 이황화결합이 형성될 것이라고 예상되는 부위가 없는데 inclusion body로 나올 수가 있느냐라고 하시며, 2 mM EDTA정도 넣으면 pellet에서 소량이라도 타겟 펩타이드를 solubilize시켜 sup.을 사용하라고 완강히 말씀하셔서 sup.으로 진행하였는데.. (2 mM EDTA를 추가하였을 경우, 해당 부근의 밴드가 sup.에서 더 진해지는 것만 확인 했을 뿐 추가적인 WB을 진행하지는 않음)

제가 pellet을 이용해서 WB을 진행하지 않았습니다..

그러니 2 mM EDTA를 추가했을 때, pellet으로 부터 타켓 펩타이드가 solubilize되었다는 것을 확인하지 않고 섣부르게 sup.에 타켓 펩타이드가 다영히 녹여져있을거라는 판단으로 실험을 진행한 것 같습니다.

 

보관중인 pellet 샘플로 WB을 진행해보는 것이 먼저일 것 같습니다.

 

정말 감사드립니다ㅠ ㅠ

뒷다리졸업은언제하나  |  10.08 02:00  

이런 경우 당연히 발현 후 정제 전 Sup.과 ppt. 두 fraction에 대한 WB를

먼저 진행 해 보는 것이 필요하겠죠.

그리고 -S-S- bond가 없어도 soluble로 가지 않는 경우도 있습니다.

 

대왕개구리SPEED  |  10.08 11:08  
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