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1. blunt로 말단을 만들어 ligation.
2. RFP 부분을 잘라내지 말고 PCR로 KpnI, AvrII로 달단을 만들어 증폭후 ligation.
위 2가지 방법이 가장 쉬울 것 같습니다.
1. pZE21-GFP을 AvrⅢ 로 자른다.
2. klenow fragment로 filling-in 해서 blunt end로 만든다.
3. 다시 KpnI으로 잘라서 정제한다 - vector.
4. pZE12-DsRed의 RFP를 XbaI으로 자른다.
5. klenow fragment로 filling-in 해서 blunt end로 만든다.
6. 다시 KpnI으로 잘라서 정제한다 - insert.
위와같이 하면 벡터와 insert 모두 KpnI + blunt end가 됩니다.
이것을 ligation하면 DNA의 양 말단이 다르므로 coning학률이 높아집니다.
Gibson assembly 방식으로 하셔도 됩니다.
벡터는 제한효소로 잘라 준비하시구요..
insert는 KpnI, AvrIII (그런데 AvrIII라는게 있나요?? AvrII 아니고??) 과 gibson assembly가 일어날수 있게 primer를 만들고 PCR로 insert를 준비합니다.
다음 벡터랑 insert (PCR)를 섞고 gibson assembly reagent 넣고 반응후 DH5a 에 transformation 하시면 됩니다.