실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
Western blot 밴드가 나오지 않습니다.
레벨1 grapefruitt (대학원생)
안녕하세요.
웨스턴을 시작한지 한달 됐습니다.
처음에 연습삼아 해보던 것은 밴드가 나오더니, 동영상보면서 따라하면서 제대로 결과 내볼려니까 밴드가 안나옵니다.
무슨 문제일까요,,?
너무 길어서 읽기 번거로우시겠지만 답변 꼭 부탁드립니다. (꾸벅)
시약과 Protocol을 적어보겠습니다.
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1. RIPA buffer: Thermo 구입하여 사용
2. Sample loading buffer (5X SDS buffer)
250mM Tris-HCl (pH6.8) 450 μl
ddH2O 250 μl
10% SDS 100 mg
30% Glycerol(v/v) 300 μl
0.05% Bromophenol blue (w/v) 0.5 mg
3. SDS-PAGE
12% Resolving gel | 5% Stacking gel |
ddH2O 4,400 μl 40% A/bis A 3,000 μl 1.5M Tris-HCl (pH8.8) 2,500 μl 10% SDS 100 μl 10% APS (0.1g APS + 1ml DW) 50 μl TEMED 5 μl |
ddH2O 3,075 μl 40% A/bis A 625 μl 1.5M Tris-HCl (pH6.8) 1,250 μl 10% SDS 50 μl 10% APS (0.1g APS + 1ml DW) 25 μl TEMED 5 μl |
4. SDS running buffer / Transfer buffer 10x
5. 10X TBST
ddH2O 500ml
0.2M Tris-HCl (FW 121.14) 12.114 g
1.5M NaCl (FW 58.44) 43.83 g
pH는 7.3으로 맞추고 Trion x-100 0.05% 넣고 사용.
전기영동과 Transfer(PVDF membrane)까지는 순조롭게 됐습니다.
1차 항체는 tAKT, pAKT, tERK, pERK를 1:15000 1% BSA in TBST에 희석한 후 3시간동안 실온에서 shaking, 냉장overnigh (냉장이 되는 shaker가 없어서 통 주변에 아이스팩을 두었습니다)
TBST로 10분간 3회 세척
2차 항체는 HRP가 결합된 anti-mouse로 1시간 실온에서 shaking
BSA 15ml + 2nd Ab 3ul --> 이것 5ml에 TBST만 15ml 넣어줌. 지난번 사용시에 타는 듯이 나와 희석해준 것
TBST로 10분간 3회 세척
검출은 ECL solution 사용하여 했습니다.
잘못된 점 생각해봤는데요...
* Sample만드는 것 부터 잘못
cell lysate 200ul + 5x sample buffer 50ul 이렇게 희석한 후 heating block에서 93도씨 10분간 둡니다.
반응이 끝난 sample은 -20도씨에 보관하여 필요시에 사용합니다.
* 항체 희석비율 문제 BSA 15ml + Ab 1ul 1:15000은 너무 희석한 걸까요?
* blocking 문제?? Transfer후 TBT로 2회 세척 후 5% skim milk에 실온 1시간 rocking
* TBST 세척 문제? Tween 20 사용해서 세척했을 때 밴드가 나온적이 있었습니다. Triton x-100으로 했을 때 더 깔끔하게 나온다는 말이 있어서 바꿨습니다. 또 세척시간이 blocking 후 10분간 3회인데 타이머 안해놔서 50분정도 했습니다.
* 항체 붙일 때 통안에 membrane을 두개씩 넣고 반응시켜줬습니다. 두 membrane이 겹치기도 했는데 가끔씩 위치를 바꿔줬습니다.
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