-
레벨1
Q.E.D.
-
19.10.03 18:15
보려고 하는 NFkB, IKK 모두 핵 속으로 들어가는거고
보려는 반응시간이 얼마인지 모르겠지만
시간에 따라 반응성이 매우 달라지기 때문에
처음부터 WB로 볼 생각하면 실험이 망합니다 ^ ^
교수님과 상의해서 실험 반응 시간을 잡고
그 후 실험을 한 후 동물의 세포든 보려는 것에서
Nuclear extract를 하고 그 추출물로
WB를 진행해야 합니다.
전 세포내 핵과 혹시 몰라서
세포질 모두에서 실험을 진행했었는데
세포를 많이 깔아도 핸들링 타임 10분 이내에
실험을 마무리 해야 핵 분해가 안 일어나서
세포를 까는데 한계가 있었어요
그래서 BCA를 진행 할 양이 부족해서
WB를 40ul로 로딩하고, lamin b1을 확인해서
정량이 다르지 않아서 그렇게 진행했는데
WB자체가 처음이면 손부터 만들고 실험을 진행하세요
안 그러면 Lamin b1이 꽤나 들쑥날쑥 할 꺼고
그러면 데이터를 못 쓰거든요
반응시간 정하기
핵 추출 방법 찾아서 연습하기
WB 기본 연습하기
요 정도면 될 듯 합니다.
-
레벨3
수서
(대학생)
-
19.10.04 09:58
답변 정말 감사드립니다!
페이지 까지는 해봐서 정량하고 넣는것은 큰 어려움은 없을거라고 생각이 드네요!
한가지 더 궁금한게 있는데요.
제가 일반적인 세포를 키워서 하는게 아니라 마우스 장기를 적출하고
lysis을 해야하는데 혹시 해보셨나요?
tissue lysis은 RIPA buffer로 하려고 하는데, 세포막을 깨고
핵 막을 깨려면 nucelar lysis buffer도 같이 넣어서 lysis해야 하는지 궁금합니다.
*실험 조건을 조금 더 적는다면...
1. 추추물 주입 후 1시간 뒤 ETOH (15g/kg)주입
2. 1시간 뒤 안와채혈로 피 회수, 경추 탈골로 장기 적출 (3%포르말린 고정)
3. 포르말린으로 고정한 장기 lysis 진행.
*포르말린에 고정되면 NFKB 변동이 심해질까요?
*포르말린에 고정하고 lysis로 이동하는 시간 까지도 생각을 해야되는지 궁금합니다.
-
레벨1
Q.E.D.
-
19.10.09 21:11
제가 이 질문을 지금 봐서 답변이 늦어져
다행히 수서님이 올린 그 간의
질문들을 볼 수 있었습니다 ^ ^
우선 세포핵 내에서가 아니라
세포질에서 NFKB를 보려는 것 같은데,
제가 올렸던 세포질을 함께 관찰했다는 부분은
제가 실험을 잘 못 했을까봐 세포질에 남아있는지
확인을 하기 위한 서브 데이터이지
본 실험용이 아닙니다.
WB로 보려면 NFKB는 핵 내에서 관찰한 데이터를 논문용으로
사용 할 수 있습니다.
세포질 데이터는 논문용으로 소용이 없습니다.
리뷰어에게 신나게 지적 받을 각오가 되어있다면
세포질로 실험을 진행하세요 ^ ^
첨부한 사진은 제 논문에 들어갔던 데이터 사진입니다.
적어도 로딩시에 정량 없이 lamin b1이 이렇게 나와야 논문용으로 쓸 수 있습니다.
실험 후 데이터 수치 정량은 당연히 진행해야 하구요.
조직이라 저보다는 양이 많을것 같아 다행이네요
전 세포라 한 번 실험에 50ul밖에 안 나와서
40ul를 로딩했는데도 시간 내에 하느라 손이 저렸거든요 ㅜㅜ
우선 동물 실험으로 진행 할 예정이라면
아무것도 처리 안한 컨트롤그룹 n
에탄올만 먹인그룹n
추출물로 보호하고 에탄올을 먹인그룹n
추출물만 먹인 그룹n
최소 이 정도 그룹으로 각 그룹당
일정 동물수가 되어야 하고
제가 시간이 없어서 에탄올의 kg당 투여양이 맞는지는
확인을 못했으니 참고하시구요
그 전 처리와 본 처리 한시간이 유의미한지는 좀 의문이 듭니다. 이 부분도 교수님과 상의하세요 ^ ^
동물 실험은 들어가는 시간과 연구비가 커지기 때문에
제가 아니라 연구비를 지원하는 분들과
상세하게 진행을 논의한 후 본 실험에 들어가는걸 추천합니다.
그리고 장기 적출을 하고 왜 고정을 하는지요?
참고로 부득이하게 고정을 한다면 4%가 좋습니다.
이 조직으로 WB를 볼 예정이 아니라
IHC라던가 조직 형태가 유지되어야 하는
실험을 진행 할 계획이라면 이해가 되지만
그게 아니라면 보관용기에 넣고 디프리져에 얼리던가
액체질소로 얼려서 보관하고 그 후 실험을 진행하세요.
버퍼의 경우는 RIPA가 아니라
전 모두 직접 만들어서 사용했기에
다른분들이 도움을 주실꺼에요!
-
레벨3
구루막
(대학생)
-
19.10.11 14:54
답변 감사합니다!
음...일단은 whole lysate로 해서 total p-IKB, IKB, NFKB을 보기로 했습니다.
반응시간은.. 예비로 한번 진행을 해봐야 할 것 같습니다 ㅎㅎ
고정을 하는것은 위 염증 면적을 측정해야 되서 그렇답니다.
물어보니, 위 일부분을 조금 떼서 lysis하고 진행하면 될 것 같습니다. ㅎㅎ
이제... protease/phosphatase cocktail을 찾아봐야 할 것 같습니다.
답변 감사드립니다 :)
-
레벨1
Q.E.D.
-
19.10.11 19:23
Total lysate도 그렇고, 전체 조직 중 일부만 가지고
lysate를 하는 부분도 걸리고 ㅜ ㅜ
실험 디자인 자체가 의문이 많이 많이 들지만
이렇게 진행하신다니 우선은 그래도 잘 나오기를 바랍니다 ^ ^
아래는 제가 마우스 뇌조직 lysate 할 때
사용한 버퍼 조성입니다.
대충 이렇게 들어가구요
제약회사시니 계산은 잘 하리라 생각되구요^ ^
버퍼 A를 쓰면 됩니다.
카달로그 넘버는 논문에서나 랩에서 쓰는거
찾아보세요~굿럭!
그리고 사진에서 잘려서 첨부하면
버퍼 A는 만들때는 보관용이라 10% NP40을 안 넣고,
-20도에 일정량을 소분해서 보관하고
사용 할 때는 사용할 총 버퍼의 양을 계산해서 녹인후,
총 볼륨의 0.1%에 해당되는 10% NP40을
양을 넣어서 사용하면 됩니다.
이게 total lysate를 만드는 버퍼에요.
-
레벨3
구루막
(대학생)
-
19.10.12 13:17
아, 혹시 네이버 JD님이신가요?
-
레벨1
Q.E.D.
-
19.10.12 19:08
그게 누군지 모르겠지만
이제 답변 다는게 귀찮아 지기에
이제 이 질문에 답변 끝!