실험Q&A를 통해 여러분의 지식을 나누어 주세요. 답변을 등록하시려면 로그인 해주세요.
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
ddCt 방법으로 계산한 거라면 분모가 되는 control sample의 값이 너무 낮은 경우. 예를 들어 발현이 없어서 영에 가까운 경우에 그렇게 됩니다.
막연한 가정이지만, 예를 든 데이터에서 유전자의 Ct값이 15-30이라고 했는데, 대조샘플에서 30이고, 다른 분석 샘플에서 15라면 dCt가 15나 되어서 2^15의 차이가 생깁니다. 이런 문제는 정량방법을 대조값에 대한 상대값으로 발현량을 정의하는 상대정량보다 절대정량으로 바꿔서 접근하면 간단히 해결할 수 있습니다. 그렇지만, 이 정도에서 실험을 정리하고 싶다면, 대조샘플(calibrator, 무처리, Time 0, 등등)을 해당 유전자가 적당히 발현되는 샘플을 적절하게 선택해서 계산을 다시 하면 됩니다. 극단적으로 예를 들어서, 최대치로 발현된 샘플을 calibrator로 선택하면 그 값은 1이 되고, 나머지 그보다 덜 발현된 샘플들의 해당 유전자 발현값은 0이상 1 이하로 계산할 수 있습니다.
-
레벨5
금강상품권
(과기인)
-
19.10.01 10:05
답변 감사드립니다!!
ddct로 계산을 하였습니다...
40 cycle을 했고, ct가 30을 넘어가는건 없었습니다..
그렇다고 14보다 작게 뜬 경우도 없는데...
짧은 경험에, 처음 보는 것인지라..
제가 답변을 조금 수정했습니다. 보시고 의문 나는 것 다시 질문해 주세요.
-
레벨5
금강상품권
(과기인)
-
19.10.01 10:16
친절한 답변 감사드립니다!
표준 곡선법의 절대 정량을 말씀해주신건지요??
약물에 대한 반응으로 인한 유전자의 발현을 비교 측정하기 위해서는,
다른 참조 샘플과 비교하여 주어진 샘플의 발현 변화를 분석 할 수 있는 상대 정량이 더 적합하다고 생각하고 있습니다...
ELISA로 추후 확인을 하려고는 하지만..
LPS 1ug/ml로 4h 처리인데,
저 정도로 차이가 나는게 실험적인 오차로만 보기에는 조금 헷갈립니다...
절대정량이 상대정량 방법에 비해 절대적으로 우월한 것은 아닙니다. 연구자가 그 분야의 정립된 관행에 따라서 선택하면 됩니다.
이건 어떤 처리에 의해서 유전자의 발현이 ON 되는 경우에 생길 수 밖에 없는 일반적인 상황입니다. LOG2(SampleX/Control) 이런 식에서 control이 0에 가까우면 무한값이 되어 가고, 또 분모의 작은 변화에 민감한 오차가 문제가 있습니다. 따라서 상대정량을 그대로 하시고, 대조샘플만 무처리가 아닌 다른 것으로 선택해서 해석하시면 될 듯 합니다.