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질문 Raw 264.7에 LPS 염증 반응이 일어나지 않습니다.
알이익명(대학원생)  | 2019.09.23 13:42

안녕하세요!

Raw264.7 cell로 NO assay 중인 대학원생입니다.

LPS로 염증 유발시켜 NO 생성정도를 보고 있는데요, LPS 자극이 되질 않아  글올립니다..

LPS는 Sigma사 L6143(Salmonella enterica 유래) 사용하고 있으며 멸균 3차 DW에 1 ug/ml 농도로 제조하여 사용하고 있습니다.

Raw cell은 96 well에 5 x 104  cell/well 로 cell seeding 하고 있고 여기에 LPS 용액을 well당 20uL씩 처리하고 있습니다.

여기에 검색해보니 Cell conflunce가 너무 많으면 LPS activation 이 낮아질 수 있고 제조한 LPS 용액이 fresh 하지 않으면 자극이 안 일어날 수 있다고 나오는데요..

제가 지금 T25 flask에 cell 키워서 계대하는데, cell이 하루만에 거의 80~90% 정도 자라고 있고, 이번에 LPS를 한달 전에 제조해서 얼려놓은걸 실온에 해동시켜 사용했습니다. 계속 얼렸다 녹였다 하지 않고 얼리고 난 뒤 한달 후에 녹여서 사용했어요.. 이게 문제일까요?? 보통 LPS 만들고 얼마동안 사용하는지 궁금합니다...

참고로 실험은 Raw cell 플레이팅 하고 24h 동안 incubation 하고, 그 후에 LPS 처리하여 2h 염증반응 후 Sample 처리, 24h 뒤에 Griess 시약 처리 하는 순서로 하고 있습니다. 

#LPS
 
#Raw
 
#NO
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2019.09.23   

셀이 문제든 LPS가 문제든 2가지중 하나일것입니다.
LPS가 사용하던 제품이라면 셀을 다시 풀던 재분양을 받으시면 해결될것입니다.
LPS가 기존 사용하던 보관되던 제품이면 LPS먼저 새롭게 구매해보시길 추천드립니다.

보통 LPS가 냉장보관으로 장시간 보관되어 있는게 아니라면 셀문제가 일반적인 문제일수 있습니다. 한달이면 짧은 시간은 아닙니다...

 

개구리당구왕빠킹  |  2019.09.23   

1. LPS 농도를 높여보세요. (처치 농도가 정확히 얼마인가요?)

2. 세포 양을 늘려보세요.

3. 이미 자극된 세포일수도 있습니다. (세포 사진이 있으면 좋습니다.)

저는 LPS solution을 1 mg/mL 으로 제조하여 -80℃에서 보관하며, 사용하는 tube는 4℃에서 보관하여 사용합니다. 1년 정도 써도 활성 변화는 못느꼈습니다. LPS 처치 농도는 1 μg/mL 정도로 합니다. Std curve로 Griess 반응이 일어나는 것이 확실하다면 세포양을 늘리는 것이 해결책이 될 수도 있습니다. 96-well plate에 최대 1.0×10^5 까지 깔아서 NO 측정하는 편입니다(보통 8-9×10^4). 

알이익명  |  2019.09.23   
첨부파일 파일첨부: 190919 Raw264.7 cell.jpg (166 KB)
이미지 첨부파일

두 분 다 답변 정말 감사드립니다.

일단 LPS 용액 새로 제조하여 냉동보관 중입니다.

LPS 처치 농도는 1 ug/ml 이며 1 mg/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml 순으로 단계희석하여 제조하였습니다. 지금은 모두 냉동보관 중이고요. 실험시 항온수조에 데워 사용하고 다시 얼릴 예정입니다. 실험 2번 할 수 있을 양만큼만 만들었어요..

실험하고 세포양 늘려서 한 번 더 해보겠습니다.

세포 사진은 그 때 사용했던 세포 사진 올려봅니다. 전체적인 conflunce만 확인한다고 배율 낮춰 찍었는데, 모양이 잘 보이진 않네요.. 거의 동글동글한 모양이었습니다.

대왕개구리SPEED  |  2019.09.23   
LPS는 최소 1ug/ml 농도가 되게 처리해야 합니다.

그리고 LPS 처리 직전의 cell 모양이 중요합니다.

첨부 사진은 어느 시점의 cell 인지 모르겠으나 너무 많이 키웠습니다.

이정도로 cell 특히 면역 세포를 키우면 TLR signaling pathway가 거의

작동 하지 않습니다.
개구리시은  |  2019.09.26   

최근에 저도 비슷한 경험으로 시행착오를 겪었습니다.

일단 저는 대체적으로 seed된 cell의 농도가 너무 적어서 반응이 잘 일어나지 않았습니다.

 

2*10^4 4*10^4 로 진행했엇을때 반응이 없었고, 

1*10^5cell/well (96well)로 seeding후 진행했을때 결과를 얻을수 있었습니다. 

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