안녕하세요?
현재 Insoluble protein을 E..coli에서 발현 후 solublization 하기 위해 연구중인 학부연구생입니다.
여러개의 Disulfide bond가 존재하는 포유류 유래 단백질입니다.
Histag 단백질과 untagged stock 모두 보유중입니다.
MBP의 경우엔 절단 후 수율이 너무 낮아 중단했습니다.
학부 공부도 하고 여러가지 실험 배우면서 하긴 했지만,. 저희 실험실에서 이 프로젝트는 거의 반년이 넘어서도 진전이 없습니다..
그래서 dialysis 를 이용한 refolding 방법을 시도해보려 하는데, 다른 논문에서는 target protein을 바로 8M urea로 Lysis 하지 않고 다른 버퍼로 lysis > sonication > centrifuge 과정을 반복했습니다.
실제로 현재 target protein은 pellet에 높은 비율로 존재하고, Supernatant에는 다른 잡밴드들이 많이 나오기에 refolding 과정을 용이하게 하려면 먼저 pellet을 분리한 뒤 solubiliztion 하는게 낫다고 판단했습니다(이전 질문에서도 들은 답변을 참고했습니다)
그래서 저는 일반적인 Lysis buffer (50 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, pH 7.5)으로 Lysis 한 뒤 sonication (20 cycle) 진행 후 13,000 rpm 으로 20분간 원심분리 한 뒤 supernatant를 분리하고
target protein이 존재하는 pellet에 이전 Lysis buffer에 8M urea가 첨가된 Lysis buffer 로 resuspension 했는데,, 약간 갈색 투명의 덩어리들이 생기고 아무리 교반하고 피펫팅해도 덩어리가 풀어지질 않아서 실험을 중단했습니다..
한번 sonication 및 원심분리 한 pellet은 8 M urea 로 solubilization이 불가능한건가요?
아니면 8 M urea 가 첨가된 Lysis buffer에 Triton X-100 을 첨가하지 않아서 pellet이 녹지 않은걸까요?
답변 남겨주시면 정말 감사하겠습니다.
요즘은 차라리 P. pastoris를 이용해서 발현하는 방법도 생각중이지만, 저희 실험실에서 Yeast expression을 한번도 해본 사람이 없어서 막막하여 최대한 E.coli 에서 expression 하는 방법으로 생각중인데 정말 쉽지 않네요..
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