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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 His-tag purification 에서 incubation
알Eternal sonata(대학생)  |  2019.09.18 20:36

안녕하세요?

학부연구생으로 연구 진행중에 있는데 His-tagged protein 정제 관련해서 질문드립니다.

이전에 MBP tag를 이용한 정제는 해보았는데, His-tag 는 특이적으로 바인딩하는것이 아니라 단백질의 다른 His 잔기가 binding 할 수 있어 이후에 이온교환 크로마토그래피 등으로 추가정제를 해야 한다는 것은 알고 있습니다.

MBP 정제시엔 resin에 binding, washing, elution 과정에서 각 스텝당 1시간 이상 shaking incubation (4도씨) 했었는데 His-tag 정제시에는 Binding 스텝만 30-60 min incubation 한 뒤에, Washing / Elution 스텝에서 incubation 하지 않고 인버팅만 하나요?

그리고 정제 이전에 sonication으로 cell lysis 후, centrifuge 하여 supernatant 만 injection 할 때 injection 이전에 syringe filter 과정이 필수적인가요?

의견 남겨주시면 감사하겠습니다.

#Histag
 
#purification
 
#protocol
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.09.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

His taq정제라고 무조건 2nd putification step을 해야 하는 것은 아닙니다.

조건이 잘 잡히면 1st step에서 충분한 purity가 나오고 단백질에 따라서는

2nd step으로 IEX 또는 size exclusion을 해야 하는경우도 있습니다.

질문을 보면 현재 batch type으로 정제하는 것 같은데 binding에는 어느정도

시간이 필요하며 최대 30분 정도면 충분합니다.

washing, elution은 10분 정도면 충분합니다.

inverting도 incubation 시간으로 봐도 무방합니다.

컬럼 정제에 사용하는 시료는 컬럼 종류에 관계없이 0.2um 필터를 사용하여

최대한 불용성 particle을 제거하는 것이 좋습니다.

좋은결과를 얻으려면 sample binding buffer와 컬럼 binding buffer의 조건을

최대한 동일하게 맞추는 것이 중요합니다.

 

알Eternal sonata  |  2019.09.22   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

sample binding buffer와 칼럼 바인딩 버퍼 조성을 동일하게 하라는 말씀이 sample lysis buffer를 의미하는건가요?? 

대왕개구리SPEED  |  2019.09.22   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

네.. buffer 농도를 동일하게 하면 됩니다.

약하게 붙은 단백질은 washing 단계에서 imidazole농도를 조금 올려 제거한 후

elution 단계에서 1step 또는 2, 3step으로 정제하면 됩니다.

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