[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
웨비나모집
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
조회 3162  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 His-tag purification 에서 incubation
알Eternal sonata(대학생)  |  09.18 20:36

안녕하세요?

학부연구생으로 연구 진행중에 있는데 His-tagged protein 정제 관련해서 질문드립니다.

이전에 MBP tag를 이용한 정제는 해보았는데, His-tag 는 특이적으로 바인딩하는것이 아니라 단백질의 다른 His 잔기가 binding 할 수 있어 이후에 이온교환 크로마토그래피 등으로 추가정제를 해야 한다는 것은 알고 있습니다.

MBP 정제시엔 resin에 binding, washing, elution 과정에서 각 스텝당 1시간 이상 shaking incubation (4도씨) 했었는데 His-tag 정제시에는 Binding 스텝만 30-60 min incubation 한 뒤에, Washing / Elution 스텝에서 incubation 하지 않고 인버팅만 하나요?

그리고 정제 이전에 sonication으로 cell lysis 후, centrifuge 하여 supernatant 만 injection 할 때 injection 이전에 syringe filter 과정이 필수적인가요?

의견 남겨주시면 감사하겠습니다.

#Histag
 
#purification
 
#protocol
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

His taq정제라고 무조건 2nd putification step을 해야 하는 것은 아닙니다.

조건이 잘 잡히면 1st step에서 충분한 purity가 나오고 단백질에 따라서는

2nd step으로 IEX 또는 size exclusion을 해야 하는경우도 있습니다.

질문을 보면 현재 batch type으로 정제하는 것 같은데 binding에는 어느정도

시간이 필요하며 최대 30분 정도면 충분합니다.

washing, elution은 10분 정도면 충분합니다.

inverting도 incubation 시간으로 봐도 무방합니다.

컬럼 정제에 사용하는 시료는 컬럼 종류에 관계없이 0.2um 필터를 사용하여

최대한 불용성 particle을 제거하는 것이 좋습니다.

좋은결과를 얻으려면 sample binding buffer와 컬럼 binding buffer의 조건을

최대한 동일하게 맞추는 것이 중요합니다.

 

대왕개구리SPEED  |  09.18 21:14  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

sample binding buffer와 칼럼 바인딩 버퍼 조성을 동일하게 하라는 말씀이 sample lysis buffer를 의미하는건가요?? 

알Eternal sonata  |  09.22 11:36  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

네.. buffer 농도를 동일하게 하면 됩니다.

약하게 붙은 단백질은 washing 단계에서 imidazole농도를 조금 올려 제거한 후

elution 단계에서 1step 또는 2, 3step으로 정제하면 됩니다.

대왕개구리SPEED  |  09.22 12:35  
답변하기
할인행사 광고 검색광고
코람바이오텍 코람바이오텍
[Proteintech] 전품목 할인 행사 !!! (12.9까지)
마크로텍 마크로텍
Ezscope Nikon 현미경 마이크로톰 특가판매 (12.30까지)
엠피바이오메디칼스코리아 엠피바이오메디칼스코리아
샘플파쇄 단 40초! 비드호모게나이저 특별할인행사: 가격할인+사은품 증정 (12.31까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
βeta
5/6  좌우
286,700
286,700
286,700
107,200102,000
79,80076,000
668,600334,000
218,200
286,700
231,000219,000
50,50048,000
49,700
130,00065,000
113,500108,000
101,90097,000
286,700
121,700
123,900118,000
231,000219,000
180,700172,000
56,70054,000
286,700
82,800
144,900138,000
137,600131,000
최근등록   더보기 >
iNOS의 역할 좀 부탁드립니다   10.17
vector DNA와 insert DNA의 transformation   10.17
한국 실험실의 경우, 실험원리 및 프로토콜 용 서적이 많이 비치 되어있나요?   10.17
혹시 lysis 하고 bradford로 정량 하시는분 계시나요?   10.17
적정 세포수를 정하기 어렵습니다.   10.17
잎 RNA 추출 질문드립니다ㅠㅠ   10.17
Western blot 시   10.17
DMSO 제거   10.17
손세균 배양 결과 입니다. 분석 바랍니다.   10.17
bacterial biofilm formation, removing bacteria 시에   10.17
한국관광공사
투표진행
Q. Protease 혹은 Phosphatase inhibitor를 넣으시나요? 웨스턴을 진행한다 가정을 하고 샘플은 셀에서 RIPA로 lysis를 진행한다할때 여러분께서는 inhibitor를 넣으시나요?
참여하기
Q. 영문교정 맘에드는곳(?) 은 어디였나요
참여하기
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아