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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 전기영동 SDS-PAGE시 샘플
알aasqss(대학원생)  |  09.18 17:36

안녕하세요. 대학원생입니다..

 SDS-PAGE 내릴때 샘플준비하는데서 문제를 겪고있습니다.

인슐린의 monomer, dimer, trimer 등을  보려고 

인슐린이 들어있는 시료 15 uL와 샘플버퍼 5 uL (2-mercaptoethanol 안넣음) 섞어서 100도에 5분간 끓인 후 18% SDS-PAGE에 내렸습니다. 

내린후 coomassie blue로 염색해서 결과를 확인했는데, 3개 lane 중 1개 lane에서 밴드모양이... 완전 물결모양으로 이상하게 나왔습니다. 

끌림현상도 존재하였고요... ㅠ.ㅠ 정말 요동을 치더라구요.

 

그래서, 여쭤보고싶은게

시료 준비할때 끓인 후 ICE에서 식힌뒤에 전기영동을 하 기전에 보면

로딩샘플이 깔끔하지않고 살짝 침전되는게 보였습니다.  부유물같은거..?

그래도 그걸 다 섞어서 그대로 로딩해서 내렸었거든요..

왜냐면 인슐린이 중성조건에서 용해도가 낮아서 침전되는게 보였기 때문에..

그래서 그냥 그걸 그대로 내렸었는데, 여기서 문제가 생긴걸까요?

하지만, stacking gel에 걸려서 내려오지 못한 단백질은 없는것으로 확인되었어요.

염색후 그 경계쪽에 염색된 단백질이 없었거든요..

 

조언 부탁드릴게요.

 

 

#인슐린
 
#SDS-PAGE
 
#coomassie
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

인슐인 pI는 5.4 ~ 6.7이기 때문에 정제된 insulin을 pH6.8 buffer에 넣으면 침전

될 가능성이 있지만 SDS-PAGE sample buufer에 들어있는 SDS때문에

pI와 관계없이 - charging되어 침전되지 않습니다.

그리고 침전된다 하더라도 시료 중에 포함된 인슐린 농도가 눈에 보일

정도가 되나요?

따라서 100도에서처리 후 침전된 단백질은 인슐린이 아닐겁니다.

열 변성으로 인하여 침전된 물질은 원심분리 후 제거하고 전기영동하면

됩니다.

변성되어 침전되는 단백질은 upper gel 안으로 들어갈수 없기 때문에

전기영동 후 염색해도 gel에서 확인이 안됩니다.

전기영동 사진을 봐야지 정확한 원인을 알수 있을것 같습니다.

대왕개구리SPEED  |  09.18 18:06  
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