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질문 PMSF와 Protease
알Eternal sonata(대학생)  |  09.10 17:20

안녕하세요?

Protease 관련 연구를 하고 있는 학부 연구생입니다.

저희가 원하는 연구를 하기 위해, Soluble, Active 형태의 protein이 필요하나

현재까지  E. coli 를 사용한 많은 조건(com cell 및 온도, vector 변화)에서 insoluble 하게 대부분 검출되고 있습니다.

 

단백질의 pI는 약 6.0이며 현재 Lysis buffer 조성은 

pH 7.4, 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.3 mM PMSF, 1 mM DTT 입니다.

여기서 PMSF가 Protease의 inhibition 역할을 하는데, 이는 저희가 얻고자하는 Protease의 solubility에는 영향을 주지 않을까요?

 

 

#solubility
 
#PMSF
 
#protease
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

위의 버퍼 조성으론 Lysis가 되지 않습니다.

triton 이나 lysozyme , sonication 해보세여

PMSF  |  09.10 17:50   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Sonication 진행해서 15 s on, 45 s off 20 cycle 처리했습니다

알Eternal sonata  |  09.11 14:52  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

원하는 단백질이 insoluble 형태로 발현되는 것은...

대부분의 경우 polypeptide 생산이 후 folding이 제대로 이루어 지지 않아서 그렇게 되는데요, 혹 본인이 원하는 단백질에 대한 단백질 구조(PDB data base)를 확인해보세요. 만일 구조가 등록되어 있다면 대부분의 경우 단백질을 soluble 상태로 정제했을 가능성이 크고, 단백질 발현 조건 뿐만 아니라 cloning 한 유전자의 서열도 확인이 됩니다. 유전자 서열 및 단백질 발현 조건을 확인하시면 해결될 가능성이 큽니다.

그리고 다른 한가지...연구중인 단백질이 protease 라면 어떤 종류인지 확인해보시는 것이 좋겠죠. 무슨 말인고 하니 PMSF의 경우 serine protease inhibitor 이며, 실험에 사용하고자 하는 단백질이 serine protease 라면 다른 종류의 protease inhibitor를 사용하셔야 합니다. 그리고 이 경우에도 protease inhibitor는 단백질의 기능을 조절하게 되며, 근본적인 단백질의 발현 상태(soluble/insoluble form)에는 영향을 주지 않습니다. 단백질의 생성 순서를 생각해보신다면 이해가 좀 더 쉽지 않을까요? ^^

ps. 혹시 필요하시다면 따로 연락주시면...함께 고민해볼수도 있구요 ^^

뒷다리볼땡땡이  |  09.15 13:38  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

감사합니다 Serine protease인데 PMSF를 쓰고있었네요.. 현재 PDB에 등록된 구조들은 E. coli에서 얻어진 경우 Refolding을 거친 것이고 그 외에는 Yeast를 이용해 expression 시켜서 얻어졌습니다..

그래서 현재 dialysis를 이용한 refolding 과정을 진행하려는데 Lysis 부터 Renaturation 까지 감이 잡히질 않네요.. 일단 문헌조사하면서 정보들정리하고있습니다.

disulfide bond가 많은 protein이라 여러 additive를 넣어주어야 할 것 같은데, 단백질 refolding 자체가 너무 어려워보여서 ㅠㅠ

일단 Lysis buffer는 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 8 M Urea 로 진행하려는데, 다른 논문들을 보니 바로 Urea로 Lysis 하지 않고 Triton X-100 등으로 washing? 이라는 과정을 거쳐 sonication 및 원심분리를 몇차례 한 뒤에 solubilization 을 진행하더라구요.. His-tagging protein과 untagged protein 모두 준비는 되어있는데 refolding에 6x His 가 안좋은 영향을 줄것 같아 untagged protein으로 진행하려고 합니다. 

Lysis buffer 에서 PMSF, DNase 등은 중요하지 않나요??

알Eternal sonata  |  09.16 10:44  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
Refolding 지옥에 오신걸 환영합니다! 리폴딩 조건을 찾는것은 굉장히 어렵고 특히나 높은 수율을 기대하기는 어렵습니다. 다만 참고문헌이 있으시다니 그냥 그대로 따라하시길 추천드립니다.

처음부터 urea를 넣지 않는 이유는 대장균 기원의 단백질과 구분하기 위해서입니다. 바로 urea처리를하면 모든 단백질이 denature되서, 그 중 protease만을 정제하기가 어려워집니다. his tag이 있다면 정제할스잇겟지만 없는걸 사용하시려면 이.절차대로 하셔야합니다. urea가 없으면 lysis후 원심분리만으로 순도높은 타겟단백질을 얻을.수.있습니다.
개구리순똘  |  09.16 20:06  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
refolding하실 계획이라면 lysis buffer에 pmsf든 protease inhibitor든 넣든 넣지 않든.큰 영향은.없을것입니다. Refolding을 하지.않으실거라면 타겟단백질이 Serine protease이기때믄에 PMSF뿐만 아니라 protease inhibitor도 비추합니다. 여기에도 serine inhibitor가 섞여있을겁니다.

긴 DNA사슬은 파이펫팅을 어렵게 만듭니다. 그래서 Lysis를 어럽게 만드는데, DNAse를 처리하먄 lysis가 쉬워집니다. 그런데 sonication을 하신다먄 DNA가 조각나기 때문에 큰 상관은.없습니다.

개구리순똘  |  09.16 20:22  
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