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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 Qiagen RNeasy mini kit 사용시 최종 일루션때 뭔가 잔여물이 같이 elute 됩니다...
알딸기스무디(과기인)  |  2019.09.10 13:11

Qiagen 사의 RNeasy mini kit를 이용하여 bacteria RNA를 추출하려고 합니다. Bacteria는 gram negative라 cell lysis에 특이 사항은 없는 것으로 압니다.

 

mercapto ethanol과 DNase도 처리를 했구요, 프로토콜대로 다 따라서 실험을 진행했습니다.

그런데 맨 마지막에 nuclease free water를 넣고 elution 하였을 때 뭔가 하얀 pellet이 자꾸 같이 보입니다.

Lysis의 문제인가 싶어서 RLT 치기 전에 lysozyme도 쳐 봤었는데 똑같이 결과가 나왔구요, pellet을 피해서 용액을 저장하면 농도와 purity가 매우 안 좋게 나옵니다.. 농도 30ng/ul purity는 1.2 정도로요..

pellet은 피페팅을 몇번 하면 녹는 것 같고, 녹은 경우에 농도는 올라갑니다. 하지만 rna가 다 부서져서 도저히 쓸 수가 없는 상태가 됩니다...

 

도대체 뭐가 문제인 걸까요?

#RNeasy mini kit
 
#RNA extraction
 
#Bacteria
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RNA  |  2019.09.11    

RNA 추출 시 Cell 양을 너무 많이 하신건 아닌가요? Cell lysis 시에

lysozyme 처리 후 RLT+bME 처ㄹ리 하고 나서 Solution이 맑아지는지 확인 하시구요 column 에 통과 후 ethanol 넣고나서 실타래 처럼 형성되는게 있는지 확인 하시는게 좋을 것 같습니다.

nano drop 도 좋지만 gel에 걸어서 확인도 해보셔야 합니다.

d.w 에 녹아있는 RNA는 절대로 침전되지 않습니당.

Dnase 는 on-column method를 사용하시는지요?

RNA  |  2019.09.11    

RNA 추출 시 Cell 양을 너무 많이 하신건 아닌가요? Cell lysis 시에

lysozyme 처리 후 RLT+bME 처ㄹ리 하고 나서 Solution이 맑아지는지 확인 하시구요 column 에 통과 후 ethanol 넣고나서 실타래 처럼 형성되는게 있는지 확인 하시는게 좋을 것 같습니다.

nano drop 도 좋지만 gel에 걸어서 확인도 해보셔야 합니다.

d.w 에 녹아있는 RNA는 절대로 침전되지 않습니당.

Dnase 는 on-column method를 사용하시는지요?

알딸기스무디  |  2019.09.13   
Dnase 는 on column식으로 처리합니다. 역시 프로토콜에 있는대로요. Cell양도 줄여는 봤는데 똑같은 현상이 발생했었구요. Rlt, b-mecap 처리시 완전히 투명하지는 않지만 원래의 균액과 비교시 상대적으로 투명하게 변합니다. 에탄올 첨가시에도 rna로 추정되는 아지랑이를 확인할수 있습니다.

혹시 Rlt 처리시 드라마틱하게 투명하게 변해야 하나요?
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