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질문 단백질의 purity (salt 안건드리고 )
올챙이단백질결정(대학원생)  |  09.08 13:27

안녕하세요 단백질을 구조결정분석 을 하고 있는 대학원생입니다. 제가 하고 있는 단백질이 낮은 salt concentration 에서 aggregation되는 것을 확인 하였습니다. 그래서 salt condition을 유지한채로 단백질의 purity를 높이고 싶은데 혹시 아시는 방법 이있나요 ?? gel filtration을 제외하고 가르쳐주시면 감사하겠습니다..!!!

#단백질
 
#purity
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 현재 정제 단계를 어느정도 거친 상태입니까?

2. NaCl 기준에 필요한 최저 농도는 어느정도 인가요?

3. aggregation은 가역적인가요?

4. 분자량이 얼마정도이고 monomer인가요?

대왕개구리SPEED  |  09.08 13:43  

단백질의 정제는 Ni-affinity 만 진행 한 상태고 반응은 비가역적이며 

제가 생각하는 salt의 최저 농도는 300 mM 입니다.!!! 아 그리고 homodimer이고 sub unut당 40 kDa입니다.

올챙이단백질결정  |  09.09 09:17  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

target protein이 재조합 단백질입니까?

비가역적인 aggregation이라고 했는데 어떻게 확인 했나요?

대왕개구리SPEED  |  09.09 10:06  

네 재조합 단백질입니다. 버퍼에 단백질을 넣고 한시간 정도 후에 centrifuge해서 sup랑 ppt sds해서 확인했습니다.!!

올챙이단백질결정  |  09.09 10:15  

아마도 비가역적이 아닐겁니다.

세포 내 에서 발현 될 때 세포내 Salt 농도가 그리 높지 않은데 그렇다면

생산된 단백질이 모두 비가역적 aggregation되어 사용하지 못할건데

어떻게 정제했나요?

- 버퍼에 단백질을 넣고 한시간 정도 후에 centrifuge해서 sup랑 ppt sds해서

확인했습니다.!!

: 현재 정제에서 가역적, 비가역적인 문제가 가장 중요합니다.

위 답변으로 봐서 어떻게 확인했는지 알지 못하겠네요.

좀더 자세히 설명 부탁합니다.

 

대왕개구리SPEED  |  09.09 10:42  

우선 답변 정말 감사합니다. 
생성 될 때에 그렇게 높은 salt concentraion이 아닌데 왜 inclusion body에서 밴드가 보이지 않고 folding이 잘 되었을까 답변을 읽고 한참을 생각해봤습니다. 가역적인가 비가역적인가도 생각을 해봤는데 정말 어렵네요... 

혹시 답변이 더 올까 기대하는 마음으로 조금 더 상황을 자세히 말해보겠습니다. 우선 제 단백질의 pI는 8.3입니다. 예전의 실험에서 ni-column으로 정제후에 sds를 확인해서 단백질의 양을 확인하고 anion exchange를 하다가 잘 안되는 것을 보고 cation exchange로 바꿔서 실험을 진행 한적이 있는데 sds에서 확인되는 단백질의 양보다 한참 못미치는 수준의 양이 정제 되어서 10 kDa의 필터로 centrifuge를 한 후에 sds로 확인해보았을 때 농축 전과 후의 밴드의 크기가 차이가 없어서 버퍼의 pH와 salt stabilty 를 확인해 본 적 이있습니다. 버퍼 10ul에 단백질 1ul(양은 확실히 모르겠습니다.)를 넣고 한시간후에 centrifuge를 해서 sup을 따내고 다시 버퍼를 넣어서 wash후에 ppt로 sds sample을 만들어서 비교했을 때 salt 100 mM일때 와 300 mM, 500 mM 중에서 100 mM은 ppt에서 밴드가 보였고 (100 mM 일때 밴드가 가장컸습니다.) 그 중 pH는 7.5에서 가장 안정하다는 것을 알게 되었습니다. 그래서 지금 salt의 농도를 줄이지 못하고 있습니다.

도움 부탁드립니다..!!! 

올챙이단백질결정  |  09.09 14:53  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 먼저 pI 8.3인 단백질은 AEX 컬럼 정제는 pH가 높기 때문에 조금 어렵구요..

CEX 컬럼으로 정제하는 것이 좋습니다.

2. CEX 컬럼에서 단백질 양이 줄어 든 것은 salt 문제가 아니라 정제 조건을

못 잡아서 그런것 같습니다.

CEX 컬럼 정제는 어떤 조건에서 어떤 방법으로 정제했는지 알수 있을까요?

3. 결론적으로 염에 의한 단백질 안정성이 문제가 되는것은 아닙니다.

가장 큰 증거는 cell에서 발현 후 cell lysis 후 원심분히하면 target 단백질이

모두 침전되어야 하는데 별 이상없이 affinity 컬럼을 진행한것입니다.

이온교환 컬럼에서 충분히 정제 가능할 것으로 보입니다.

affinity 정제 후 purity가 얼마나 되나요?

affinity 정제 및 CEX 정제 후 SDS-PAGE 사진 같은 걸 볼수 있을까요?

 

대왕개구리SPEED  |  09.09 15:17  
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20190909_161014861_01.jpg (312 KB)
이미지 첨부파일

 

왼쪽에 있는 사진은 CEX입니다. 다른 피크들도 다 확인했을때 13 to 23이라고 쓰여져 있는 피크만 제 단백질이었습니다. 그 후 테일링이 약간 보이는 것 같아서 프랙션별로 확인을 한것이구요 22 번 프랙션에서 다른 밴드가 하나 보이네요 sds가 진하게 나온것은 ni column이후 확인한것입니다. Elute buffer volume은 총 10 mL x 5개 총 50 mL이고 각각 6 uL 씩 따서 sds를 진행하였습니다. 그 후에 5 mL 만들고 small scale로서 1 mL 씩만 CEX 진행한 크로마토그램입니다. volume을 줄이는 와중에 단백질이 줄어든 건 맞는거같은데요 ㅠㅠ... upload_image

올챙이단백질결정  |  09.09 16:18  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

data는 잘 봤습니다.

1. affinity 이후 purity가 상당히 높은데 좀더 정제하기 위해서 CEX를 하는

건가요?

2. CEX에서 안붙은 fraction은 전기영동 안해봤나요?

3. 비 정상적인 CEX chromatogram으로 보입니다.

따라서 CEX에서 단백질 loss가 생긴것 같습니다.

4. CEX 관련 문의를 드립니다.

- CEX는 어느 pH에서 어떤 buffer로 실험했나요?

- resin과 sample의 평형화는 어떤 방법으로 했나요?

- 첨부 chromatogram에서 elution NaCl 농도 범위는 ?

정제만 제대로 하면 CEX에서 거의 99% 이상 purity가 나올 것으로 예상합니다.

대왕개구리SPEED  |  09.09 17:05  

 

네 결정화를 하고 있기 때문에 좀 더 높은 purity의 단백질이 필요해서 정제를 더 진행하고 있습니다. 안붙은 fraction이 무엇을 말하는지 정확하게는 모르겠지만 피크별로 전부 체크하였고 그 후 밴드가 나온 피크만을 더 세밀히 진행한 결과입니다.  버퍼는 pH 7.5에서 진행을 하였습니다. NaCl의 범위는 20 mM~ 1 M 입니다. 그 후에 조금 중간 부분에서 피크가 나왔기 때문에 조금 sharp한 밴드를 만들기 위해서 300 mM ~ 1 M 로진행하였지만 좋은 결과를 얻지는 못했습니다. ni column후에 100 mM 의 NaCl을 20 mM 까지 희석하였고 같은 버퍼로 컬럼에 흘려준 후에 실험을 진행하였습니다.

아까 했던 질문 한번더 여쭤보고싶습니다. ni - affinity후에 volume을 줄이기 전과 후의 sds 밴드 사이즈가 같은건 어떻게 생각하시나요 ?? 이 부분에서 단백질을 loss했을 가능성은 없다고 보시나요? ㅠㅠ

올챙이단백질결정  |  09.09 17:46  

실험을 보니 IEX 컬럼에 대한 지식이 별로 없으신것 같습니다.

pI8.3단백질이 pH7.5 CEX 컬럼으로 정제를 하면 일단 resin에 거의 붙지를

않습니다. 

또한 resin이나 sample이나 정확한 IEX 컬럼을 위한 평형화가 거의 이루어

지지 않아서 CEX 컬럼 정제가 될수가 없습니다.

더욱이 resin에 sample을 apply할 때 NaCl이 들어있으면 처음 조건 잡을 때는

안됩니다.

resin에 sample을 apply하고 나서 resin에 안붙은 fraction은 아래 첨부 사진에서

붉은 box에 있는 fraction입니다.

이 부분도 전기영동 해 봤나요?

- affinity후에 volume을 줄이기 전과 후의 sds 밴드 사이즈가 같은건 어떻게

생각하시나요 ?? 

: 무슨뜻인지? 당연히 농축과 관계없이 단백질 분자량은 동일하게 나옵니다.

 

upload_image

대왕개구리SPEED  |  09.09 18:16  

답변 잘듣고있습니다. 얘기 할 수록 많이 부족하다는 것을 느끼고 있습니다. !! sds 관련부분은 처음 단백질을 50 mL에서 6 uL의 샘플을 땄을 때와 10 mL로 volume을 줄인 후에 6 uL의 샘플을 땄을 때 밴드의 크기가 같게 나왔습니다. 많은 양의 단백질을 loading 했기 때문에 더 큰 밴드가 나올걸로 예상했는데 그렇지 않았습니다 !  그리고 IEX 관련부분은 더 공부를 한 후에 실험을 진행해보겠습니다.!!  

올챙이단백질결정  |  09.09 19:28  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

그 정도 농축으로는 크기 변화가 거의 없습니다.

그리고 CEX에서 붉은 box fraction에 아마도 target 단백질이 99% 포함되어

있을겁니다.

당연히 실험 조건에서는 CEX resin에 거의 안붙기 때문이고 따라서 NaCl elution

에서 일부 붙은 단백질이 elution되었기 때문에 약한 band로 나왔을 겁니다.

예전에는 protein purification 책이 많이 나왔는데 요즘에는 참고 할 만한 책이

별로 없더군요.

IEX 컬럼도 상당히 복잡한 실험이기 때문에 처음 배울 때 정확히 배우는 것이

좋습니다.

대왕개구리SPEED  |  09.09 19:33  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

지나가던길에 첨언해 봅니다. 

우선 농축후, "밴드 두께에 크기가 차이가 없다"

- 왜 SDS로 농도를 확인하나요? UV로 확인 하면 간단한데... 이유가 있을 수도 있겠으나....

- 농축비율이 10배 정도 된것 같은데 정상적이라면 밴드두께 차이가 있어야 하는건 맞습니다. 하지만 salt 문제인지는 모르겠네요... centricon으로 농축하셨을것 같은데 멤브레인을 빠져나온 flow through도 확인해 보시면 좋을것 같습니다. 멤브레인 사이즈 선택이 잘못되었을 수도 있고... 드문 케이스이나 linear한 구조의 단백질일 경우, size와 상관없이 농축이 잘 되지 않는 경우도 있었습니다. 

크로마토 그래피 관련

- 다른분이 말씀해 주신것 처럼... 크로마토그램 프로파일은 전체적으로 문제가 있습니다.

1. 우선 혹시 농축하여 loading하신건지...  CEX를 하는데 농축은 불필요합니다.

2. 평형조건 테스트 필요

3. 그리고 말씀하신데로 load에 나온peak 확인 필요합니다. 

4. gradient 조건등 테스트 필요 등이라고 생각합니다. 

 

그냥 지나가다가 대충 보고 말씀드리는 거니 참고하세요~

 

jeon8856@newflight.co.kr  |  09.10 10:12   

답변도 첨언도 모두모두 감사합니다. !!! 많은 도움이 되고 있습니다. 

우선 빨간색으로 표시해주신 피크는 이미 한 번 확인을 하였습니다. 저기에 나온 모든 피크들은 확인을 하였습니다. 그리고 저 넓은 부분에서만 제 단백질이 확인이 되었습니다!! 첫 peak가 waste로 흘러가는 도중에 제가 잘못받은게 아니라면 (전부 받았기 때문에 그럴 확률이 적고, volume이 커서 농축도 하고 sds gel에 loading 하였습니다. ) 제 단백질이 아니라고 생각중입니다. 그리고 ph 와 salt stability test를 진행하였을 때 낮은 salt concentration에서 단백질이 aggregation이 되는 것을 확인 하였기 때문에 salt concentration을 이용한 ion exchange를 사용하기 힘들다고 판단했기에 다른 정제방법을 여쭤보고싶습니다!!

올챙이단백질결정  |  09.10 17:19  
저도 구조를 연구하는 사람입니다만, 위에 젤사진을 보면 Ni컬럼으로도 순도는 충분해보입니다. 바로 농축시켜서 Size-exclusion을 통과시키면 95이상의 순도는 될거같네요. 농축시 손실이 우려되신다면 위에 언급한데로 flow through의 농도를 항상 체크해보십시요. 스핀이 너무 빠른경우, 혹은 mw cut-off가 맞지않는경우 단백질도 빠질수있습니다.
앞다리SCIENTIST00  |  09.13 09:30  
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