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질문 SDS PAGE로 단백질 정량시에 PBS 샘플 주입시...이상합니다.
뒷다리시은(대학원생)  |  2019.09.06 21:53

SDS PAGE로 단백질 정량을 하고있는 대학원생입니다.

이전에는 DMEM또는 tris buffer등으로 buffer change를 한 단백질을 정량했었고, 그때는 거의 큰 문제는 없었습니다.

근데 최근에 PBS로 buf. change한 단백질 sample을 로딩하여 gel을 내려보면 찌그러지는 모양? 이라고 해야하나 그런식으로 내려와서 제대로 정량이 불가능 한 상황입니다. 이게 단순히 재료의 문제 인지..아니면 다른 분들도 혹시 PBS에 들어있는 sample을 로딩했을때 저희처럼 이러한 결과가 나오지는 여쭤보고싶습니다.

지금 생산하는 단백질이 impurity들도 많고 생산량도 매우 적게 나오는단백질이라 이거말고는 크게 정량방법이 없는상황입니다

이런경험이 있으셨거나 관련되서 아시는 분들께서는 꼭 좀 답변 부탁드리겠습ㄴ다 ㅠㅠㅠㅠ

#SDS PAGE
 
#gel
 
#protein
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.09.06   

band가 넓게 퍼지는 것은 시료 문제인데.. 찌그러지는 것은 어떤 모양인가요?

찌그러진 모양 종류도 수없이 많으며 그 모양에 따라 원인이 다를 수가 있습니다.

gel 문제가 50% 이상, 시료 문제가 50% 이하로 보입니다.

전기영동 관련 문제는 사진이 있으면 거의 문제 해결이 가능하지만 말로 설명

하면 실험자 주관적인 표현이기 때문에 이정도 답변 밖에 할수 없겠네요.

뒷다리시은  |  2019.09.08   

upload_image

위가 최근에 Buf가 PBS인 경우고


upload_image

하단이 DMEM으로 했을때의 사진입니다.

최근에 Tris 20mM NaCl 0~300mM사이에 들어있는 sample로딩 시에는 하단과 비슷하게 gel이 내려왔습니다ㅠㅠ

 

대왕개구리SPEED  |  2019.09.08   

위의 gel에서 sample 7개 모두 PBS인가요?

그리고 아래 8개 sample 모두 DMEM인가요?

뒷다리시은  |  2019.09.08   
아, 두 gel모두 마케제외하고 세번째줄이 각각 PBS DMEM입니다.
이렇게보니 한 줄 때문에 저렇게 될까 싶은 생각도 드네요. 그런데 최근에 내린GEL모두 PBS가 들어있는 Sample하나만 있어도 저렇게 내려왔습니다..
타이밍이 문제인지 정말 PBS문제인지 헷갈리네요
조만간 다시 PBS샘플을 내려볼예정이긴합니다만...
그외 sample들은 binding,elution buffer와 dw입니다..
대왕개구리SPEED  |  2019.09.08   

이온교환 컬럼으로 정제하면서 시료를 SDS-PAGE 할 때 phosphate buffer를

사용할때도 있는데 전기영동에 별 영향이 없습니다.

그리고 PBS에 들어 있는 NaCl도 별 영향을 안줍니다.

gel에 PBS 시료를 마커 없이 2, 5, 8 lane에 loading하고 3, 4, 6, 7 lane에는

sample buffer만 loading해서 전기영동 해보세요.

아마 buffer 영향은 아닐겁니다.

gel 위는 더 내려오고 아래부분은 덜 내려오는 pattern은 처음 보는 pattern입니다.

뒷다리시은  |  2019.09.09   
한번해보겠습니다 감사합니다!
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