정확하게 비율대로 넣으면 별 문제 없습니다.
모든 실험이 마찬가지겠지만
1ul 이하에선 파이펫팅에 의한 오차가 커지는 걸 주의하셔야 합니다.
또 농도는 모르겠지만 volume으로 판단하면 vector양이 너무 많아보이네요.
ligation은 insert를 더 많이 넣어야 수월합니다. (volume이 아닌 g기준으로)
buffer는 5X 농도 입니까?
실제 ligation사용한 v, i의 양은 어느정도 인가요?
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레벨2
TRV2Vector
(대학생)
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19.09.04 15:11
vector 농도는 8.469ng/ul 이고 insert는 12.567ng/ul입니다!
비율은 1:3(vector:insert)로 계산하여 넣은것이고!
원래 NEB t4 ligase를 썼을땐 total 10ul로 잡고
vector 7.8ul
insert 0.7ul
bfr 1ul
t4 ligase 0.5ul
를 넣어서 진행하였습니다!
ligation vol.은 10ul를 하든지 20ul를 하든지 아무런 관계가 없습니다.
다만 v, i는 적정 양을 사용해야 하고 buffer도 반응 부피에 따라서 적정양을
사용하며 됩니다.
질문에는 10ul 반응 부피에 buffer를 2ul를 사용해서 5x 인지 물어봤습니다.
계산을 해보니 vector와 insert 크기 차이가 23.25배 정도 입니까?
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레벨2
TRV2Vector
(대학생)
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19.09.04 15:50
아아 제가 질문을 너무 정신없이 읽어버렸네요 죄송합니다
bfr는 5x가 맞구 vector는 9.6kb에 insert는 0.4kb입니다!
v, i의 비율은 맞습니다.
그러나 1 : 3 비율이 아니면 cloning이 안되는 것은 아니고 실험자 마다 익숙한
방법으로 cloning을 하면됩니다.
저의 경우 질문과 같은 짧은 DNA의 cloning은 insert 비율을 5까지 올려서 합니다.
먼저 현재 방법으로 cloning을 해보세요.
DNA 농도가 조금 낮은 느낌도 있고 일반적으로 vector 양이 적으면 cloning이
잘 안됩니다.
다른 연구자는 어떤지 모르겠지만 항상 cloning에는 vector0.1 ~ 0.2ug 정도
사용해 왔는데 질문의 경우는 0.058ug정도 되는것 같아 조금 적은 느낌이
듭니다.
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레벨2
TRV2Vector
(대학생)
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19.09.04 17:06
답변 정말정말 감사드립니다!!
혹시 실례가 되지않는다면 ligation할때 조성짜는 계산법좀 공유해주실수있으신가요?
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레벨2
TRV2Vector
(대학생)
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19.09.04 17:52
vector 랑 insert를 넣는 비율 계산법이라고 해야하나요?
직접 계산하는 방법과 web site를 이용하여 자동으로 계산하는 방법이 있습니다.
저는 주로 직접계산을하는데..
- 직접 계산하는 방법
예) v: 3,000bp / i:500bp, 1 : 3으로 ligation한다고 가정하면
1. 먼저 v, i의 분자량 비율을 계산합니다.
: 3,000 : 500때문에 1 : 0.167 정도됩니다.
동일한 양을 혼합하면 v=1일 때 i는 6배가 말단이 많습니다.
2. 사용할 v의 양을 정합니다.
가령 v=0.1ug을 사용한다면i의 경우 0.1ug을 사용한다면 v 대비 6배의 말단이
많습니다.
3. i의 양을 정합니다.
v : i를 1 : 1로 혼합하면 말단은 1 : 6이 되기 때문에기 때문에 i의 양을 1/2로
줄이면 1 : 3이 됩니다.
따라서 v=0.1ug일 때 i=0.05ug을 사용하면 됩니다.
- web site를 이용하여 계산하는 경우
: web site는 상당히 많은데 그 중 하나를 알려드리면..
https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation
위 site를 이용하면 됩니다.
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레벨2
TRV2Vector
(대학생)
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19.09.04 18:21
정말 친절히 계속 답변해주셔서감사합니다 ㅠ 답답하셨을텐데 한번더 정말 정말 감사드립니다!! ㅠㅠ 꼭 실험 잘 마무리하겠습니다!
답답한 점은 없습니다.
실험 잘 하시길 바랍니다.