사용 promoter에 따라 달라지기 때문에 반드시 IPTG 유도를 해야 발현되는
것은 아닙니다.
사용 promoter가 Lac, T7이고 LacI & LacO 조절 system이면 lactose, IPTG에
유도 됩니다.
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흑야화
(과기인)
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19.08.30 14:31
그럼 배지 조성에 있는 casein이 있던데 이게 lactose에 해당될까요?
promoter에 따라 달라지니까 어떤 promoter를 사용하나요?
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레벨5
흑야화
(과기인)
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19.08.30 16:15
pET SYSTEM이라 T7을 사용합니다.
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레벨5
흑야화
(과기인)
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19.08.30 17:01
정리해보면, 전 pET 21a의 T7 promoter를 사용하는데, 배지는 TB로 사용했습니다. 그런데 Control인 without IPTG에서 발현이 되었는데.. 어떻게 해석을 해야할까요?
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레벨5
흑야화
(과기인)
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19.08.30 17:10
아니면, yeast extract에서 carbohydrate 성분 중 이당류인 유당이 존재해서 그럴 수도 있나요?
배지 성분 때문에 유도되는 경우는 못봤습니다.
pET21a는 T7 promoter + lacO 구조로 발현이 됩니다.
IPTG 없이 발현되었다면 host 문제(DE3 균 아닌 경우)와 T7 promoter가 아닌 경우
외에는 가능성이 낮을 것으로 보입니다.
-IPTG에서 많은 양이 발현되나요?
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흑야화
(과기인)
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19.08.30 18:45
pET 21-a 기준 BL21(DE3) TB 배지로 키운 샘플입니다.
위에 그림이 SDS-PAGE 상에서의 발현인데 Control에서도 발현이 보입니다.
이를 아래 그림 (W.B)에서도 anti-his 에서 검출이 됩니다.
따라서 위 답변에도 설명 했지만 새로운 BL21(DE3)를 사용하고
vector의 T7 promoter와 LacO를 염기서열 분석을 해보세요.
그리고 vector의 LacI도 정상인지확인해 보는게 좋지 않을까 합니다.
T7 프로모터를 사용하는 발현시스템에서 IPTG 없이 발현되는 경우가 많습니다. 이는 IPTG 없이 T7 RNA pol이 발현되는 경우입니다.
이것을 leak 또는 leakage라고 부릅니다.
여러 유전자를 같은 벡터, 가령 pET15b에 클로닝해서 발현을 시켜보면 대부분의 경우 IPTG 없이 빌현이 안되지만 종종 IPTG 없이 발현이 되는 경우가 있죠.
발현되는 단백질이 대장균 성장에 영향이 없다면 비싼 IPTG 없이도 다량의 재조합 단백질을 얻을 수 있으니 좋지만, 대장균에 해로운 단백질이라면 좀 난처한 상황이 생깁니다.
그래서 종종 T7 RNA pol을 억제해주는 T7 Lysozyme을 발현하는 pLysS 를 동시에 사용하기도 하는데 이때 T7 lysozyme은 leak으로 발현된 소량의 T7 RNA pol과 결합해서 IPTG 없는 induction을 못하게 합니다.
IPTG 처리로 과량의 T7 RNA pol이 발현되면 일부 T7 lyzyme에 붙잡힌 T7 RNA pol을 제외한 나머지 과량의 T7 RNA Pol이 재조합단백질을 합성합니다.
올리신 젤사진을 보니 IPTG를 처리하나 안하나 induction은 비슷하니 그냥 대장균을 TB 같은 배지에서 대량배양해서 (IPTG 처리 없이)재조합 단백질을 정제하시면 되겠네요.
수십개 단백질을 발현 시켜봤지만 전혀 경험해 보지 못했습니다.
한번 경험해보면 좋겠네요.