실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
Primer design에서 의해서 cloning 이 안될수도 있는지 질문드립니다.
레벨1 minaU (과기인)
안녕하세요. TA cloning 및 Primer design 질문입니다.
제가 환경시료에서 특정 이차대사산물 생합성 효소 DNA를 확인하기 위해서 primer를 설계했습니다. 그 이후 각 DNA의 종을 확인하기 위해서 cloning을 했는데 이상하게 밴드가 합성이 안됩니다.
일반 PCR로 1500bp에서 band가 합성되는 걸 확인했구요. purification 후 cloning을 수행했습니다. 너무 안되길래 배지에 있던 colony를 한번에 다 긁어서 일반 colony PCR을 했었는데 그때는 band가 확인되었거든요. 그런데 각각 colony를 PCR 하면 밴드가 보이지 않구요...50개든 100개든 이상하게 band가 확인되지 않습니다.
DNA 양이 부족했나 싶어 정량해 봤더니 양이 부족하지도 않았습니다.
primer design 할 때 원핵생물도 exson 부분을 제외하고 만들어야되나요? 1500bp면 중간에 exson 부분이 들어갈 수도 있는데 그럼 PCR에서는 band가 확인되고 cloning에서는 안되는건가요?
일단 exson부분을 제외한 800bp정도의 primer를 다시 제작해서 실험을 진행할려고 하는데 아무리 생각해도 이해가 안되서 질문드립니다..
제한효소는 사용하지 않고 단순한 cloning만 하는겁니다..
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