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질문 Anion exchange chromatography 하기 전
알베리타스(대학원생)  |  2019.08.23 22:31

안녕하세요,

Anion Exchange Chromatography를 하기 전, 제가 원하는 물질의 pI 값을 찾아 보기 위해 아래와 같은 실험을 진행하려고 합니다:

upload_image

이 실험을 하기 위해서, 어떻게 하면 bead의 양을 동일하게 맞춰 줄 수 있을까요? (단순히 volume 으로만 맞춰줘야 하는지 궁금합니다)

그리고 resin equilibration 할 때 보통 어떻게 하는지도 궁금합니다. 제가 구입한 resin은 20% alcohol에 들어가 있는데, dialysis 혹은 amicon centrifugal filter로 buffer exchange를 해 줘야 하는건가요?

더불어 buffer를 사용하는대신 DI water를 HCl등으로 pH를 조절하여 위 실험을 진행해도 무방한지 궁금합니다.

감사드립니다:)!!

#anion exchange chromatography
 
#protein
 
#ion exchange chromatography
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.08.23   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

이온교환 수지를 이용한 pI 추정 실험은 resin과 sample의 pH를 test pH로 각각 평형화를해야 합니다.

예를 들어 첨부그림 처럼 pH를 test하려면 각 pH로 평형화된 5개의 resin과 5개의 sample을 준비해야 합니다.

그리고 pH 보정은 buffer로 해야 합니다.

resin은 부피로 어느정도 맞추면 됩니다.

pH별 resin 양이 조금 차이가 나더라도 문제는 없습니다.

음이온 교환 수지 평형화 순서는

- resin의 평형화는 원심관을 사용해도 되고 비이커, test tube 모두 가능합니다.

1. DW로 washing(5Resin Vol.)

2. 0.5N NaOH로 washing(2~3Resin Vol.)

3. DW washing(5Resin Vol.)

4. 각 pH로 평형화(5Resin Vol.)

5. 최종 pH확인

부피가 작은 sample의 pH 보정은 5K UF filter tube를 사용하여 buffer 교환을 해주면 됩니다.

참고로 질문의 그림처럼 결과가 나오면 pI는 6.5부근입니다.

알베리타스  |  2019.08.23   
안녕하세요 빠른 답변 너무 감사드립니다 ㅜㅠ
Resin 의 평형화 과정 말씀해 주셔서 너무 감사드립니다. 조금 더 궁금한점이 있습니다. 혹 resin volume은 sample volume에 따라 변화를 주어야하는건가요? 제가 200ul~500ul sample volume을 생각하고 있습니다.
그리고 resin 평형화 과정에서 washing 할때, 예를 들어 1번 스텝처럼 DI water로 워싱을 한다면, resin부피의 5배가되는 di water양을 넣고 "원심분리"를 해주면 되는건가요? 흔들거나 pipette up and down등이 필요한지도 궁금합니다.
그리고 각각 다른 ph인 buffer를 만들때, buffer 종류가 달라져도 되는건가요? 예를들어, ph6은 l-histidine buffer, ph8은 trizma hcl buffer 이런 식으로요!
감사드립니다 ㅜㅜ
대왕개구리SPEED  |  2019.08.23   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. pH 별 buffer는 pH 범위가 좁으면 1개의 buffer로 될수도 있지만 질문과같이 넓은 경우 다른 buffer를 당연히 사용합니다.

phosphate buffer로 pH6.0 ~ 8.0까지 가능하지만 pH7.5, 8.0은 tirs-HCl buffer로 사용하는 것도 괜찮습니다.

2. ion exchange resin에 사용하는 시료의 양을 정하는 기준은 부피가 아닌 단백질 양입니다.

사용 resin의 spec.을 보면 mg에 결합 가능한 단백질 양이 나와있기 때문에 단백질 양을 기준으로 최소 2배 이상의 reins을

사용하세요.

3. 원심관을 사용하여 평형화를 한다면 resin 부피의 3배의 DW를 넣고 피펫팅은 resin입자 직경때문에 안되고 잘 저어준 다음

원심분리 후 DW를 제거하고 한번더 resin 부피의 3배의 DW를 넣고 잘 저어준 후 원심분리 후 DW를 제거하면 됩니다.

알베리타스  |  2019.08.23   
안녕하세요 speed님!
너무 많은 도움이 되었습니다 ㅠㅠ
한가지만 더 질문 드리고자 합니다. 제가 찾아봤을때 anion exchange chromatography에선 보통 phosphate buffer가 not recommended로 나와있던데 -->이 부분은 굳이 상관 없는건가요?
감사드립니다!!
대왕개구리SPEED  |  2019.08.23   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

단백질 정제를 처음 시작하고 20년도 넘게 사용했는데 정제에 별 문제점은

없었습니다.

그리고 단백질 정제가 이론적으로는 쉬운데 실제 변수가 엄청 많습니다.

평형화 버퍼의 농도는 20mM 이하로 사용하세요.

이온 강도가 높으면 붙을 단백질도 안붙고 pH가 더 올라가야지 붙습니다.

실험하다가 궁금한점 있으면 speedk89@naver.com 언제든지 연락주세요.

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