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질문 pCambia 1302 vector 내에 있는 하이그로마이신
올챙이옷궤짝이다(대학생)  |  2019.08.23 18:06
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20190823_180611290.jpg (560 KB)
이미지 첨부파일

pCambia 1302 vector 내에 있는 하이그로마이신 서열을 사용하기 위해서 CaMV 35S promoter가 필요하다는 걸 알았는데요 !1 ㅜㅜㅜ

promoter + 하이그로마이신+ terminator 가 아니라

역순으로 terminator + 하이그로마이신+ promoter 이렇게 벡터가 구성되어 있습니다 ㅜㅜㅜ 

그러면 염기서열을 거꾸로 읽어서 해야하는데 또 거꾸로 블라스트를 돌리면 그 서열이 안나옵니다 ㅜㅜㅜ 

 

제가 지금 하고싶은것은 pCambia 1302 벡터에 있는 하이그로마이신을 끄집어 내서 Xba 1 으로 디자인 한 뒤, T-vector에 클로닝 해서 기존에 가지고 있는 A 벡터에 다시 클로닝 해서 A 벡터가 하이그로마이신 저항성을 갖게 하려고 하는데요 ㅜㅜ 도데체 어떻게 해야 할까요 ?ㅜㅜㅜ

#하이그로마이신
 
#pCambia
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.08.23   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

저번에는 1300 vector를 사용하다고 했던데 이번에는 1302 vector를 사용하네요.

CaMV 35S promoter는 hygromycin ORF 앞에붙어 있습니다.

시계 반대방향으로 유전자가 배열되어 있기 때문에 아래 가닥을 사용하면

됩니다.

PCR primer에 XbaI 자리를 붙여 PCR 후 정제해서 T vector에 cloning하면 됩니다.

올챙이옷궤짝이다  |  2019.08.24   

답변 감사합니다! ㅜㅜ

그런데 혹시 하이그로마이신 ORF가 어디에 위치 해 있고, 

아랫가닥을 사용하라는 말씀이 어떤 말씀이신지 더 자세히 알려 주실수 있으실까요..?

 

ata ctt ttt tcg gac ttg agt ggc gct gca gac agc tct tca aag act agc ttt tca agc tgt cgc aga ggc tgg act acg tcg aga gcc tcc cgc ttc tta gag cac gaa agt cga agc tac atc ctc ccg cac cta tac agg acg ccc att tat cga gct aag gcc ttc acg aac tgt aac ccc tca aat cgc tct cgg act gga taa cgt aga ggg cgg cac gtg tcc cac agt gca acg ttc tgg acg gac ttt ggc ttg acg ggc gac aag atg ttg gcc agc gcc tcc gat acc tac gct agc gac gcc ggc tag aat cgg tct gct cgc cca agc cgg gta agc ctg gcg ttc ctt agc cag tta tgt gat gta ccg cac taa agt ata cgc gct aac gac tag ggg tac aca tag tga ccg ttt gac act acc tgc tgt ggc agt cac gca ggc agc gcg tcc gag agc tac tcg act acg aaa ccc ggc tcc tga cgg ggc ttc agg ccg tgg agc acg tgc gcc taa agc cga ggt tgt tac agg act gcc tgt tac cgg cgt att gtc gcc agt aac tga cct cgc tcc gct aca agc ccc taa ggg tta tgc tcc agc ggt tgt aga aga aga cct ccg gca cca acc gaa cat acc tcg tcg tct gcg cga tga agc tcg cct ccg tag gcc tcg aac gtc cta gcg gtg ctg agg ccc gca tat acg agg cgt aac cag aac tgg ttg aga tag tct cga acc aac tgc cgt taa agc tac tac gtc gaa ccc gcg tcc cag cta cgc tgc gtt agc agg cta ggc ctc ggc cct gac agc ccg cat gtg ttt agc ggg cgt ctt cgc gcc ggc aga cct ggc tac cga cac atc ttc atg agc ggc tat cac ctt tgg ctg ggc ggt cgt gag cag gct ccc gtt tct tta tc

이 서열이 하이그로마이신을 뒤집어서 적어본 건데 ㅜㅜ

번거러우시게 죄송합니다 ㅜㅡㅡㅜ

 

promoter 서열이 어딘지 체크 해주실 수 있으실까요..?

대왕개구리SPEED  |  2019.08.24   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

앞전 질문에 답을 한것을 참고 했습니까?

유전자 발현을 위해서는 promoter - ORF - terminator(Poly A)가 있어야 하는데

이 질문에서는 CaMV35S promotet - hygromycin ORF - poly A 전체가

있어야 합니다.

각각의 위치는

promoter : 9492 - 8712

ORF : 8676 - 7651

Poly A : 7635 - 7427

따라서 9492 - 7427까지의 염기서열을 포함해야 합니다.

primer는 증폭 대상 서열에서 +50bp정도 여분을 가지고 디자인하면 됩니다.

올챙이옷궤짝이다  |  2019.08.24   

답변 너무 감사드립니다! ㅜㅜ

저희 교수님께서 계속 하이그로마이신에서 ATG 랑 TAA 를 찾으라 그러시고,

 promoter 중에서 -35 -10 region 을 찾아라 하시고 ..ㅜㅜㅜ

저는 계속 이해가 안돼서 욕만 먹고 있었습니다.. ㅜㅜㅜ

시계 반대방향으로 뒤집어져 있으니 반대방향으로 서열 정리해서 블라스트 돌려서 그 서열이 맞는지 확인해 보라고 하시고...ㅜㅜㅜㅜ

 

그러면 foword서열은 9492 서열 (promoter)부터 잡아서 시계 반대방향으로 프라이머를 디자인 하고, reverse 서열은 

7427(poly A) 부터 시계 순방향으로 프라이머를 디자인하면 될까요//?ㅜㅜ

계속 여쭤봐서 죄송합니다... 논문이나 다른거를 참고해도 이해가 안되는 부분이여서요 ㅜㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  2019.08.24   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

먼저 promoter 상류로 +50bp에서 poly A에서 하류로 +50bp까지 염기서열을

잘라내어 역방향 서열을 정방향 서열로 바꿔보세요.

서열을 정리해서 올리면 promoter, ORF, poly A 위치를 알려드리겠습니다.

올챙이옷궤짝이다  |  2019.08.24   
첨부파일 파일첨부: CaMV hph polya 서열 뒤집은것.hwp (16 KB)

감사합니다!!

뒤집어서  서열 정리한 거 첨부합니다!

대왕개구리SPEED  |  2019.08.24   

서열이 잘못되었습니다.

speedk89@naver.com으로 연락주시면 설명드리겠습니다. 

개구리무광  |  2019.08.25   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

질문자께선 Complement sequence에 대해 모르는 것 같습니다.
분자생물학 전공자가 아닌 것인가요?

plasmid의 아랫가닥을 읽으란 말 (시계 역방향)은 바깥을 그대로 역으로 읽으란 말이 아니고 대응하는 Complementary sequence를 5' -> 3' 방향으로 읽으란 뜻입니다. 

올려주신 pCambia 1302 plasmid seq를 snapgene에서 받은 후 
hygR에 해당하는 서열입니다

upload_image

질문자께서 올려주신 바깥가닥을 시계역순으로 읽은 서열은 3' -> 5' 방향으로 올려주신 것으로 아무런 의미가 없습니다.
(A/TACTTT~, 젤 앞의 A는 HygR에 해당하지 않습니다. 형광펜의 입력자의 오기인것 같군요) 
밑에 서열을 5' -> 3' 으로 읽어보면 ATGAAA~~로 읽어집니다.

plasmid에서 promoter등이 시계역순으로 표시된건 바깥 가닥의 상보적 서열에 해당하는 아랫가닥을 시계역순으로 읽으라는 겁니다.

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