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질문 mouse T cell stimulation 시간 알려주세요 ㅜㅜ
알연규조(대학원생)  | 2019.08.22 17:56

 

mouse에게 어떤 물질을 in vivo로 먹인 뒤 희생하여 spleen으로부터 T cell을 분리하여 자극 한 뒤 t cell subset의 분포와 cytokine분비를 측정하는 실험을 계획중입니다.

 

t cell자극은 cd3/ cd28로 할 예정인데, 얼마나 자극 후에 facs분석이나 상층액분석을 해야하는지 잘 모르겠어요..

 

다른 논문들 찾아봐도 정말 시간이 다양하던데, 어떤 분석을 하기 위해서는 꼭 몇시간 이후에 측정해야한다던지 이런것들이 있을까요???

 

또 자극시간에 따라서 t cell 수가 나와있는 논문 추천해주시면 감사하겠습니다..ㅠ

 

 

#t cell
 
#activation
 
#culture
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리지나가는사람  |  2019.08.23   

보통 자극은 2hr~4hr 정도로 줍니다.

알연규조  |  2019.08.23   

24시간 이내로 자극해도 t cell subset으로의 differentiation을 확인할 수 있나요?

개구리지나가는사람  |  2019.08.23   

그리고 CD3, CD28로 자극준다하셨는데,

 

저의 경우 T cell을 분화시키기위해

 

LN 를 MACS or Aria로 sorting 후에 naive T cell만을 얻습니다.

 

그리고, culture 전날에 CD3/28 을 96 well에 coating ( O/N ; 14~16 시간 )을 합니다.

 

그리고 다음날 PBS 로 2 wash 해주고 원하는 분화 조건에 따라 분화를 시켰습니다.

 

주로 TH1, TH2, TH17, 그리고 iTreg 으로 유도시켜 실험을 진행하였습니다.

 

그리고 염증관련해서 자극을 줄때 PMA/Ionomycin 을 4~6시간 처리하여 염증성 cytoin Ab를 이용하여 확인하였습니다.

알연규조  |  2019.08.24   
네 감사합니다. 그런데 72시간 이상 자극하는 건 다른 이유가 있을까요..?? FACS로 cell phenotype 보는 것 역시 4시간 정도 자극 후에 진행해도 차이가 확실히 있을까요??
ㅇㅇ  |  2019.08.24    

관찰하시려는 T cell subsets가 CD4 T cell subset이라는 가정하에 답변드리면,

 

CD4 T cell 분화를 시킬 때는,

Treg/Th17 세포는 2~3일

Th1/Th2 세포는 3~5일 정도 CD3/CD28으로 자극을 줍니다.

 

분화된 세포를 확인하기 위한 stimulation을 할 때에는 (cytokine production),

3-5 시간으로도 충분합니다. 

FACS를 통해서 cytokine을 측정하기 위해서는 Golgi stop을 처리하여야 intracellular staining을 통해 확인할 수 있습니다.

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