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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 Proteinase K ,RNAse A 활성온도 와 Incubation 시간
올챙이z크핫z(대학생)  |  08.21 09:55
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혹시 2x 10^6 cell genomic DNA extraction 할때

Proteinase K  20ul 와 RNAse A 10ul를 넣고 상온에서 2min간 반응후에 Protocol상 하면 밴드가

희미하게 생성이 되고 cell 량에 비해 얇게 밴드가 나오게 됩니다.

K 와 A 의 활성온도가 궁금합니다.

적당한 Incubation 온도와 시간을 알고 싶습니다.

#Prteinase K
 
#RNAse A
 
#Genomic DNA
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

proteinase K는 37도에서 50~60도까지 반응이 가능합니다.

처리시간은 시료에 따라 다르지만 cell의 경우 적어도 10분은 처리해야 합니다.

RNase A는 15도~70도 까지 반응이 가능합니다.

처리시간은 cell이 분해되어 RNA가 노출이 되어 있으면 1~2분 처리해도 RNA가

분해됩니다.

대왕개구리SPEED  |  08.21 11:44  

매번 감사합니다.

올챙이z크핫z  |  08.21 13:11  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

추가로.. Proteinase K 는 SDS 같은 detergent 가 약간 있을 때 활성이 올라갑니다.

Cell lysis 하실 때, SDS 가 들어간 Lysis buffer 를 쓰지 않고 PBS 에 Proteinase K 만 쓰신다면,

Lysis buffer 를 쓰시거나, PBS 에 SDS 를 0.5%-1% 정도로 넣고 proteinase K 처리 후 56 도에서 30분 이상 Lysis 하시면 더 잘 lysis 될겁니다.!

개구리Marine  |  08.21 13:47  

그럼 1% SDS 를 얼마나 넣어야 하나요?

Proteinase K 20ul 를 넣는 기준에서요 ㅠㅜㅠ

올챙이z크핫z  |  08.22 12:47  
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